一种柳树尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因SpUGE1在植物重塑细胞壁成分、减少细胞器镉含量及提高抗镉性的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，涉及一种柳树尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1在植物重塑细胞壁成分、减少细胞器镉含量及提高抗镉性的应用。

背景技术：

1、土壤在人类生产、生活、生存中起到重要的作用，重金属污染土壤会对植物和人类健康造成严重的风险。cd是植物的非必需元素，具有生物毒性强和分布广泛的特点，常以化合物形态分布于自然界中，在生态系统中具有很强的迁移性，是影响植物生长的主要重金属污染之一。研究发现，cd在植物组织中过量积累会导致植物生长迟缓、植株矮化、根系褐化、叶片黄化脱落等，光合速率和叶绿素含量的降低也会严重影响光合作用，导致细胞膜损伤，破坏细胞结构，进而导致一系列生理生化平衡的失调。

2、植物细胞壁是植物生物量的主要组成部分，并保护植物细胞免受胁迫攻击。植物细胞壁是高度动态的结构，可以在植物生长过程中重塑，并对各种实验应激做出反应。植物细胞壁的基因改造被认为是一种有前途的方法，可以改善植物生长和植物对环境胁迫的抗性。

3、udp-glucose 4-epimerase是目前研究比较清楚的一类核苷酸糖转化酶，它催化了udp-d-葡萄糖(udp-glucose，udp-glc)与udp-d-半乳糖(udp-galactose，udp-gal)之间的转化。udp-d-半乳糖是半乳糖参与生物合成过程的活性形式，它是植物合成细胞壁多糖的重要物质，在植物细胞壁果胶、半纤维素、纤维素以及胞质的多糖中都含有大量半乳糖残基；udp-d-半乳糖还与多种植物糖蛋白的核心寡糖连接，参与细胞信号转导过程；它还是贮存代谢物棉子糖和水苏糖的合成底物。因此，uge作为udp-d-半乳糖合成途径中的关键酶，对于维持细胞内udp-d-半乳糖与udp-d-葡萄糖的动态平衡起到关键调节作用。

4、植物修复是利用植物固定提取等方式去除土壤镉的过程，对环境友好、可实现原位修复、增加碳汇。柳树是高效吸收镉的木本植物，能够有效移除土壤中30-50％的镉，目前已广泛应用在国内外镉污染土壤修复工程中，但在高镉立地环境中，超富集柳树如何能提高抗性，吸附镉的机理还不清楚，负责柳树细胞壁解毒的关键基因及其功能尚不明确。因此挖掘并解析负责柳树镉吸收解毒关键基因的生物学功能，能为利用基因工程提高柳树修复能力提供重要的基因资源。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1及其在抗镉中的应用。本发明利用柳树中的关键基因，提高了转基因植株在镉胁迫中的耐受能力，对镉污染土壤修复工程具有重要意义。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1，所述spuge1基因的编码序列如序列表seq id no 1所示。

4、本发明还提供了一种重组表达质粒，所述质粒能特异表达spuge1。

5、优选地，所述质粒能提高植物对镉的抗性。

6、本发明还提供了一种抗镉污染的转基因植株，其特征在于，所述转基因植株是由上述重组表达质粒转化到根瘤农杆菌eha 105中，再由根瘤农杆菌eha 105导入宿主细胞培育而成。

7、优选地，所述宿主细胞来自于拟南芥细胞组织。

8、本发明还提供了一种抗镉的重组质粒构建方法，具体包括以下步骤：

9、s1、pcr扩增spuge1的编码序列，并纯化pcr产物；

10、s2、将纯化产物转如大肠杆菌top10并测序获得spuge1-pclone007-top10菌株；

11、s3、以spuge1-pclone007-top10菌株为模板，获得含有两个限制性位点xbai和bamhi的cds序列，通过双酶切方法获得spuge1-pcambia2301-ky重组表达质粒。

12、优选地，步骤s1中所述pcr扩增过程的反应液配制如下：1μl cdna为模板，1.5μl正向和反向引物10μmol，5μl 2mm dntps，3μl 25mm mgso4，5μl 10×pcr缓冲液，1μlkod酶和32μl ddh2o。

13、优选地，所述pcr流程如下：预变性：95℃10min；变性：95℃50s；退火：58℃50s；延伸：72℃60s，循环35次，延伸72℃10分钟。

14、本发明还提供了上述尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1或上述重组表达质粒或上述转基因植株在提高植物抗镉中的应用。

15、本发明的有益效果：

16、本发明首次从柳树中提取到尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1，其具有转运镉的活性，利用该基因构建拟南芥转基因植株，可以提高植株对镉的耐受性。该基因应用于植物工程中，对镉污染土壤修复工程具有重要意义。

技术特征：

1.尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1，其特征在于，所述spuge1基因的编码序列如序列表seq id no 1所示。

2.一种重组表达质粒，其特征在于，所述质粒能特异表达spuge1。

3.根据权利要求2所述质粒，其特征在于，所述质粒能提高植物对镉的抗性。

4.一种抗镉污染的转基因植株，其特征在于，所述转基因植株是由权利要求2所述重组表达质粒转化到根瘤农杆菌eha 105中，再由根瘤农杆菌eha 105导入宿主细胞培育而成。

5.根据权利要求4所述转基因植株，其特征在于，所述宿主细胞来自于拟南芥细胞组织。

6.一种抗镉的重组质粒构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，步骤s1中所述pcr扩增过程的反应液配制如下：1μl cdna为模板，1.5μl正向和反向引物10μmol，5μl 2mm dntps，3μl 25mm mgso4，5μl 10×pcr缓冲液，1μlkod酶和32μl ddh2o。

8.根据权利要求7所述pcr扩增过程，其特征在于，所述pcr流程如下：预变性：95℃10min；变性：95℃50s；退火：58℃50s；延伸：72℃60s，循环35次，延伸72℃10分钟。

9.权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1或权利要求2-3任一项所述重组表达质粒或权利要求4-5任一项所述转基因植株在提高植物抗镉中的应用。

10.权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖-4-表异构酶基因spuge1或权利要求2-3任一项所述重组表达质粒在减少植物细胞壁镉含量中的应用。

技术总结本发明属于基因工程领域，具体涉及一种柳树尿苷二磷酸葡萄糖‑4‑表异构酶基因SpUGE1在植物重塑细胞壁成分、减少细胞器镉含量及提高抗镉性的应用。本发明提取柳树中的SpUGE1基因，通过构建重组质粒将其转入拟南芥中，比较野生拟南芥和转基因拟南芥的生物活性和Cd<supgt;2+</supgt;浓度等。实施例结果表明，转基因拟南芥对镉胁迫具有一定的耐受性，且转基因拟南芥的细胞壁明显加厚，细胞器中镉的含量显著降低。技术研发人员：周洁,王璞,张珏受保护的技术使用者：江苏省林业科学研究院技术研发日：技术公布日：2025/1/13