放射敏感性正反馈基因表达放大载体、其构建方法及其应用与流程

本发明涉及肿瘤基因治疗，尤其涉及一种放射敏感性正反馈基因表达放大载体、其构建方法及其应用。

背景技术：

1、p53（抑癌基因）动力学决定细胞命运的发现，为肿瘤治疗带来新的机遇。p53是细胞最重要的肿瘤抑制因子之一，被誉为“基因组卫士”，能够启动细胞自毁程序；大象因p53拷贝数高而癌变率极低，50%以上的人类恶性肿瘤有p53基因突变。因此，p53靶标治疗一直是肿瘤学领域的重要研究方向，但多年来进展缓慢。

2、近来发现，p53表达动力学差异决定细胞命运。环境应激后细胞内p53表达动力学呈现两种模式：一种是脉冲式振荡，主要发生在低水平dna损伤的细胞；另一种表现为持续高水平表达，主要是由过于严重或难以修复的dna损伤引起。进一步研究发现，p53动力学变化特征影响着细胞生死：脉冲式表达可引起p21等下游分子表达增加，致细胞周期阻滞和基因修复,细胞得以存活；而持续高水平表达则诱导puma等表达增强，引导细胞走向凋亡或衰老。

3、数学建模提示，p53动力学形成机制主要与反馈调控环路调控有关，脉冲式振荡变化主要由p53-mdm2和p53-wip1-atm两个负反馈环路所致，而在p53-pten-akt-mdm2正反馈环路发挥优势作用时p53呈现持续高水平表达。以上发现加深了对p53生物学作用的认识，也拓展了肿瘤治疗研究思路。

4、调控p53动力学治疗肿瘤，主要存在肿瘤靶向性差、p53表达活性较弱以及环路元件内源性干扰等不足，具体而言：

5、一是缺乏肿瘤靶向性：从蛋白水平围绕p53动力学反馈调控开展的研究，主要集中于p53-mdm2负反馈环路的调控，利用mdm2抑制剂阻断其对p53的反馈抑制作用，把负反馈变成“正缺乏肿瘤靶向性向调控”，产生p53持续表达，最终导致肿瘤细胞命运走向死亡。初步的动物及临床试验均表明，nutlins等mdm2抑制剂在血液肿瘤及多种实体瘤显示出良好疗效。有报道，nutlins联合放疗呈现出显著的放疗增敏作用，虽然在常规条件下，放射也可引起野生型p53表达增加，但往往因表达水平低而致放疗抵抗，提示p53动力学调控可望成为放疗敏感性修饰的可靠方案。但存在的问题是血液和器官毒性较大，其原因在于mdm2负反馈环路抑制剂缺乏肿瘤靶向性，导致正常组织也出现高水平的p53表达，产生不必要的毒性反应，阻碍了临床应用；

6、二是p53的表达活性不够强：合成基因环路是利用不同生物分子和基因元件构建出的人工生物系统，通过在活细胞中感受、整合和处理分子信号，行使特定生物功能，比如双稳态开关、振荡器和细胞通讯等模块化功能单元。本技术的发明人前期探索把合成基因环路引入p53基因转录调控，基于肿瘤缺氧微环境，构建了缺氧/辐射双重敏感性基因环路，诱导p53基因在肿瘤组织特异性表达，较好地改善了肿瘤靶向性。但这种方法存在的主要缺陷是p53的表达活性不够强，未能获得p53在细胞内的持续高水平表达，还不能引起肿瘤的完全消退；

7、三是内源性表达的干扰：由于合成基因环路的元件主要来自于哺乳细胞，和宿主细胞具有一定同源性，容易受到内源性表达的干扰，影响p53表达调控的精准度和稳定性。

8、综上，虽然调控p53动力学治疗肿瘤前景良好，但现有研究存在各自的缺陷，一是肿瘤靶向性较差，引起全身毒性；二是表达强度较弱，影响肿瘤疗效；三是环路元件内源性表达的干扰。

9、因此，有必要探索精准调控p53动力学的新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的之一，就在于提供一种放射敏感性正反馈基因表达放大载体，以解决上述问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种放射敏感性正反馈基因表达放大载体，所述载体为pe6-luxi-luxr，其具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3、其中，pe6具有如seq id no.2所示的核苷酸序列，luxi-luxr具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。

4、本发明的目的之二，在于提供一种上述的放射敏感性正反馈基因表达放大载体的构建方法，包括下述步骤：

5、（1）合成基因片段；

6、（2）骨架载体的质粒提取和线性化处理；

7、（3）目的基因构建入线性化表达载体中；

8、（4）转化反应产物到stbl3感受态细胞中；

9、（5）质粒载体鉴定。

10、作为优选的技术方案，步骤（1）的具体方法为：设计并合成pe6-luxi-luxr，然后进行pcr扩增，得到目的基因插入片段。

11、作为进一步优选的技术方案，所述pcr扩增的反应体系和条件为：

12、反应体系的组成：2x m5 hiper sybr premix es taq 25μl、正向引物（10um） 1 μl、反向引物（10um）1 μl、模板（20~100 ng/μl） 4μl，ddh2o补至50 μl；

13、反应条件：95℃预变性 2min，随后进行30个循环的：变性 95℃ 20s、延伸/退火60℃ 30-34 s、72℃ 3min，最后进行72℃ 10min的最终延伸步骤。

14、作为优选的技术方案，步骤（2）中，所述线性化处理的方法为：用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2 μg，10 x反应buffer 5 μl，限制性内切酶各1μl，用水补足 50 μl，于37℃金属浴锅中孵育2 h以上。线性化处理的目的是为了便于插入目的基因片段。

15、本发明的目的之三，在于提供上述的放射敏感性正反馈基因表达放大载体在驱动p53基因中的应用。

16、为了进一步解决p53表达的肿瘤靶向性，发明人曾利用放射敏感性调控元件cargs诱导目的基因（指p53），获得了时空特异性表达，为解决上述问题提供了可靠的方法。cargs是存在于早期生长反应基因-1（egr-1）启动子的一种辐射敏感性调控序列cc(a+t)6gg，在常态下无活性，但在照射后诱导下游基因表达迅速短暂增加。将cargs与目的基因相耦联，在实施局部照射时诱导目的基因表达，通过射线的时空效应把目的基因表达局限于肿瘤部位，避免全身毒性反应。因此，本技术将放射敏感性元件cargs用于p53动力学的时空特异性表达调控，获得肿瘤靶向性表达。

17、基于上述分析，本技术通过优势互补、整合利用cargs的时空特异性和luxr/luxi环路的放大功能，构建放射感应性正反馈环路并驱动p53基因，实现肿瘤靶向性持续高表达，且无内源性干扰，同时克服前述三方面的不足。其基本原理是：

18、（1）利用射线激活细胞内的放大环路并调控下游基因表达：luxr/luxi反馈环路的激活需要一定初始水平的luxr刺激，然而，由于哺乳细胞内缺乏luxr的基础表达，该基因环路处于“沉寂”状态。因此，需要给此环路安装一个感应激活装置，即放射反应元件cargs，后者在射线作用下可诱导luxr表达短暂增强，进一步激活正反馈环路，最终通过射线“遥控”放大环路在肿瘤部位“定向引爆”；

19、（2）驱动p53靶向肿瘤的持续高水平表达及放疗增敏作用：利用双顺反子表达载体，把野生型p53 cdna置于上述环路的下游并导入肿瘤细胞；通过射线激活的luxr/luxi放大环路获得p53在肿瘤细胞持续高表达，启动细胞凋亡程序，获得放疗的靶向增敏效应；

20、本技术将cargs元件与luxr/luxi环路串联，利用双顺反子表达载体驱动报告基因gfp表达，验证其放射感应性和放大作用；再与野生型p53cdna藕联，导入p53缺失、突变或野生型肺癌细胞，通过体内外实验观测照射后p53动力学模式、时空分布特征及靶向增敏效应。

21、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的放射敏感性正反馈基因表达放大载体pe6-luxi-luxr能够驱动p53基因，实现肿瘤靶向性持续高表达，且无内源性干扰，并且目的基因表达局限于肿瘤部位，避免全身毒性反应。