一种含神经酰胺和D型氨基酸的具有抗衰功效的复合红茶发酵液的制作方法

本发明涉及红茶发酵，尤其是涉及一种含神经酰胺和d型氨基酸的具有抗衰功效的复合红茶发酵液及其制备方法。

背景技术：

1、红茶是由新鲜茶叶经深度发酵制成的完整发酵茶。红茶中抗氧化活性成分主要为茶黄素、茶红素和茶褐素，其中茶红素是红茶茶汤中红物质的主要成分，它的收敛性、刺激性弱于茶黄素。褐色素含有氨基酸、糖类等结合物。当然红茶中还有部分儿茶素物质。上述物质主要通过直接清除氧自由基、阻断脂质过氧化、络合金属离子、抑制氧化酶的活性、激活抗氧化酶活性等多种途径来实现清除自由基，达到抗氧化、减缓皮肤衰老、提高皮肤光泽等作用。

2、神经酰胺(ceramide)是由长链脂肪酸与鞘氨醇的氨基经脱水而形成的一类酰胺化合物。天然存在的神经酰胺常见于酵母、植物及一些哺乳动作组织中。植物鞘胺醇属于神经酰胺的前体，可以帮助生成神经酰胺，从根源上可帮助皮肤自己去生产各类所需的神经酰胺。它与胆固醇(25％)、游离脂肪酸(15％)一起构成细胞间脂质(神经酰胺50％)，参与维持皮肤屏障功能。人体角质层中40-50％的皮脂由神经酰胺构成，它在保持角质层水分的平衡中起着重要作用，神经酰胺具有很强缔合水分了能力，它通过在角质层中形成网状结构维持皮肤水分。随着年龄增长，体内神经酰胺在渐渐减少，皮肤缺少它后就会变得暗沉干燥，补充神经酰胺也能减少细纹和衰老迹象。

3、在红茶的功效成分中，茶氨酸、茶多酚和茶黄素等已经被广泛报道。近年来，d型氨基酸也逐渐受到关注。例如，在红茶中d-半胱氨酸可以用作抗氧化剂，具有消炎和抗氧化的作用。d-丙氨酸可促进表皮角质形成细胞产生粘连蛋白332，维护皮肤稳态。d-谷氨酸具有保护皮肤屏障功能并促进其功能恢复的作用。

4、因此，在红茶发酵过程中生成神经酰胺和d型氨基酸将增强红茶的功效，使得红茶发酵液在化妆品方面具有极大的市场潜力和附加值。除此之外，红茶发酵过程中还可以产生多肽、生物表面活性剂等成分，也将提升红茶的价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种含神经酰胺和d型氨基酸的具有抗衰功效的复合红茶发酵液。本发明的复合红茶发酵液制备过程中可以生成神经酰胺和d型氨基酸，从而增强了红茶发酵液的功效，增加其市场价值。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种含神经酰胺和d型氨基酸的具有抗衰功效的复合红茶发酵液，所述复合红茶发酵液的制备方法包括以下步骤：

4、s1、构建一株生产神经酰胺的菌株；

5、s2、构建一株生产d型氨基酸的菌株；

6、s3、培养生产神经酰胺菌株的种子液；

7、s4、培养生产d型氨基酸菌株的种子液；

8、s5、准备红茶提取液；

9、s6、将步骤s3和步骤s4制备得到的种子液离心、重悬后加入到步骤s5制备得到的红茶提取液中进行发酵；

10、s7、对得到的红茶发酵液进行分离，获得最终的复合红茶发酵液。

11、优选的，步骤s1所述生产神经酰胺的菌株为在野生型解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)中通过表面展示的方法表达磷酸脂肪酶；所述磷酸脂肪酶的氨基酸序列如seqid no.1所示。

12、优选的，步骤s2所述生产d型氨基酸的菌株为在枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中表达谷氨酸消旋酶、丙氨酸消旋酶以及天冬氨酸消旋酶，所述谷氨酸消旋酶、丙氨酸消旋酶以及天冬氨酸消旋酶的氨基酸序列分别如seq id no.2-seq id no.4所示。

13、更优选的，所述的谷氨酸消旋酶、丙氨酸消旋酶以及天冬氨酸消旋酶通过质粒表达，或者整合到基因组表达。

14、优选的，步骤s3所述神经酰胺生产菌株的种子液的培养方法为：将步骤s1制备得到的生产神经酰胺的菌株转移至种子培养基中，25-37℃条件下振荡培养12-72h；

15、所述的种子培养基的配方为：葡萄糖20g/l，酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，自然ph。

16、优选的，步骤s4所述d型氨基酸生产菌株的种子液的培养方法为：将步骤s2制备得到的生产d型氨基酸的菌株转移至lb培养基中，25-37℃条件下振荡培养12-72h；

17、所述lb培养基的配方为：酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，自然ph。

18、优选的，步骤s5所述红茶提取液的制备方法为：将红茶研磨至粉末状，加入纯净水，在50-100℃条件下慢火煮10-240min，离心、过滤并收集滤液。

19、更优选地，步骤s5中，红茶与纯净水的质量比为1:15-25，更优选为1:20；

20、更优选地，步骤s5中，制备条件为在70℃慢火煮30min；

21、更优选地，步骤s5中，使用0.22μm的滤膜对红茶提取物进行过滤除菌。

22、优选的，步骤s6所述的发酵过程为：

23、m1、首先将重悬的生产神经酰胺菌株的种子液按0.1-20％接种量接种至红茶提取液中，加入1-50g/l灭过菌的葡萄糖，15-37℃培养2-12h；

24、m2、然后按0.1-10％接种量接种重悬的生产d型氨基酸菌株的种子液，15-40℃条件下继续培养2-12h；

25、m3、随后加入1-10g/l的鞘磷脂和1-20g/l的半乳糖，15-37℃条件下继续培养2-12h；

26、m4、最后将温度提升至40-45℃继续培养1-2h。

27、更优选地，步骤s6中，种子液离心和重悬的方法为：将制备的神经酰胺生产菌株种子液和d型氨基酸生产菌株种子液分别离心后，用纯净水清洗3次，然后用纯净水重悬。

28、优选的，步骤s7所述红茶发酵液的分离方法为：红茶发酵液经过高压均质机对菌体进行破碎后，离心分离得到上清液；对上清液继续使用陶瓷膜或者0.22或0.45μm的滤膜进行过滤除菌，得到最终的复合红茶发酵液。

29、更优选的，所述破碎的过程为使用1000bar压力破碎2-4次；所述离心分离的条件为5000g以上离心至少10min。

30、本发明有益的技术效果在于：

31、1、本发明构建了一种能够生产神经酰胺的菌株，可以增加红茶发酵液中的神经酰胺含量；还构建了一种能够生产d型氨基酸的菌株，可以增加红茶发酵液中的d型氨基酸含量。

32、2、利用本发明所述方法制备得到的复合红茶发酵液中，神经酰胺和d型氨基酸的含量显著增加，使得得到的复合红茶发酵液在化妆品中使用时，能够提升其抗氧化、皮肤修护以及增强皮肤屏障等性能。同时，发酵过程中还可以产生多肽、表面活性素、果酸等物质，实现了多重活性。

33、3、本发明的制备方法不仅可产生多种活性成分，包括多肽、表面活性素、果酸等，而且可产生神经酰胺以及多种d型氨基酸，这些活性成分在增强红茶发酵液的抗氧化性能、皮肤修护、增强皮肤屏障、重构皮肤生态平衡等方面具有显著优势，提升了红茶发酵液的功效以及使用价值。