基于生物膜的双包埋纳米载药系统及其制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米载药，特别涉及一种基于生物膜的双包埋纳米载药系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纳米载药系统是一种利用纳米粒子搭载药物的特殊剂型，通过纳米载体的包裹，药物不仅能够增强治疗效果，降低不良反应，还可通过基团于纳米载体表面的修饰，成为智能响应型靶向药物体系。其中以生物膜为基础的纳米载药系统作为一种仿生药物载体具有更加优秀的性能，生物膜外层是磷脂双分子层构成的膜，内部是一个空腔可以负载大分子、小分子和核酸类物质，具有良好的生物传递性以及缓释作用，但是使用过程中依旧会发现生物膜与药物的相容性问题以及药物本身不稳定的问题，导致药物包载率不高，包载不均匀，稳定性较差。

2、为了改善纳米载药系统的性能，现有技术比如西南医科大学附属医院的cn113133988b提供了一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统，采用红细胞膜包裹醋酸泼尼松龙(pa)，借助红细胞膜提高了纳米载药系统的性状和稳定性；再如中山大学的cn113425700b提供了一种基于蛋白自组装的纳米药物载送系统，利用小分子和血清白蛋白的自组装构建纳米药物载送系统，以提高稳定性和包裹效率，但是此类技术都侧重于对单一的包裹膜的性状进行优化或者选择合适的单一包裹膜，其制备得到的纳米载药系统无法兼容生物利用率和稳定性的特点，一般认为纳米载药系统的稳定性提高的话则其较难在到达关键靶点上发挥效果，若是纳米载药系统的生物利用率高的话则其在生产和贮藏过程中容易出现质量问题，导致药物疗效变差。

3、换言之，随着药物研发技术的不断发展，创新药物层出不穷，虽然可以采用纳米载药系统进行载药，但是由于纳米载药系统的缺陷，会出现一些药物不稳定，在生产与贮藏过程中容易出现质量问题，导致药物疗效变差的问题，或者或出现一些药物生物利用度不高，难以到达关键靶点上发挥作用的问题，因此亟需一种可同时解决药物的安全与生物利用度问题的创新双包埋纳米载药系统。

技术实现思路

1、本技术方案提供了一种基于生物膜的双包埋纳米载药系统及其制备方法和应用，将环糊精包合物的优势与生物膜的优势进行结合，提高药物的载药量，提高药物的生物利用度，降低药物刺激性，增加药物有效作用时间。

2、为了清楚理解该方案，首先对该方案中涉及到专业知识进行介绍：

3、环糊精：是一种环状低聚糖，其具有一种独特的环状结构，环中心的圆筒状空腔具有亲脂性，能够包合一些水溶性差的脂溶性物质，其外表亲水特性能够使其在水中分散均匀，保持体系的稳定，因此可以利用环糊精与有效成分结合，提高其水溶液体系中的溶解度和稳定性。

4、生物膜：是一种动态的结构，具有膜脂的流动性和膜蛋白质的运动性，其表面有蛋白质、糖类、核酸等生物体信号分子，能够模拟人体内源性物质功能以及生物过程，生物利用度更高，具备一定的靶向富集作用。

5、为实现以上目的，本技术方案提供一种基于生物膜的双包埋纳米载药系统，包括：生物膜以及包合在生物膜内的纳米粒，其中纳米粒由环糊精包合药物形成。

6、也就是说，本方案提供的基于生物膜的双包埋纳米载药系统为双包埋体系，首先利用环糊精包合药物形成纳米粒，由于环糊精具有稳定的内部疏水外部亲水的环状结构，故采用环糊精初包裹药物的方式可以能够增加药物包载率以及体系稳定性，使药物在体系中分散均匀；再用生物膜包合纳米粒，由于生物膜存在于人体正常生长分泌过程，与人体具有很高的生物相容性，故使得其更容易被胃肠道吸收而发挥药效，提高药物生物利用度，从而降低药物及材料的用量，起到降低毒副作用的效果。

7、值得一提的是，现有技术也有采用单一生物膜包合药物的方式，但是生物膜本身和药物的相容性差且药物本身存在不稳定的问题，导致单一生物膜包合药物的方式存在包载率不高，包载不均匀，稳定性较差的问题，另外虽然生物膜中含有脂质体，但是生物膜表面有蛋白质、糖类、核酸等生物体信号分子，相较于脂质体在人体内的生物相容性更好，而本方案则是借助环糊精的稳定环状结构，提高了纳米载药系统的药物包载率和体系稳定性。而若是采用单一的环糊精包合药物的方式，但是环糊精单独包裹物的生物利用度较低，而且大量的环糊精还会引起消化不良和肾毒性，而本方案则是借助于生物膜同人体的生物相容性，且提高被胃肠道吸收的效率发挥药效，进而提高药物生物利用度、降低药物及材料的用量，起到降低毒副作用的效果，另外，生物膜包裹具有一定的缓释作用，能够增加药效作用时间，使药物更充分的到达细胞内靶点发挥药物。也就是说，故本方案提供的双包埋纳米载药系统结合生物膜和环糊精各自的优势以弥补彼此的缺陷，解决现有药物存在溶解性、稳定性和生物利用度不足的问题。

8、在一些实施例中，所述生物膜选择为红细胞膜、白细胞膜、血小板膜、肿瘤细胞膜或细胞质膜囊泡的一种，此类生物膜具有生物相容性、安全性、稳定性以及缓释性的特点。

9、在一些优选的实施例中，所述生物膜优选细胞质膜囊泡。细胞质膜囊泡是革兰氏阳性细菌正常生长过程中分泌的一种膜囊泡，在生物体中担任货物运输与递送作用，细胞质膜囊泡能够保护其包埋的分子不受到外界不利条件的影响，进行中长距离运输，同时根据偏好与某种类型细胞特异性融合。细胞质膜囊泡经过处理之后，生物相容性和安全性较高，通过高压挤出的方式能够将环糊精包载的药物包入生物膜中。

10、在一些实施例中，所述环糊精选择为α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精的一种。在一些优选实施例中，所述环糊精选择为β-环糊精。优选的β-环糊精相较于α-环糊精和γ-环糊精，拥有大小适中的分子洞，包接范围广，能够被生物膜再次包裹。

11、在一些实施例中，所述药物包括化学合成药物、天然小分子药物、天然大分子药物以及生物合成药物的一种。当所述药物为化学合成药物时，药物可选择为苯乙基间苯二酚、羟丙基四氢吡喃三醇、n-羟乙基棕榈胺、维生素a的一种。当药物为天然小分子药物时，药物选择为黄芩苷、槲皮素、二氢杨梅素、儿茶素的一种。当药物可选择为天然大分子药物时，药物可选择为透明质酸钠、胶原蛋白、葡聚糖、植物多糖的一种。当药物可选择为生物合成药物，药物可选择为麦角硫因、γ-氨基丁酸、肌肽、谷胱甘肽的一种。在一些优选的实施例中，所述药物为视黄醇。

12、在一些优选实施例中，所述环糊精选择为β-环糊精，所述生物膜选择为细胞质膜囊泡，所述药物为视黄醇，本方案采用β-环糊精和细胞质膜囊泡做成的基于生物膜的双包埋纳米载药系统，该基于生物膜的双包埋纳米载药系统有着较高的稳定性和较高的生物利用度。

13、在一些实施例中，所述生物膜采用天然提取得到。当生物膜为细胞质膜囊泡时，采用高压微射流均质法破碎菌体得到破碎溶液，通过固体层析柱分离纯化破碎溶液得到。

14、第二方面，本方案提供了一种基于生物膜的双包埋纳米载药系统的制备方法，包括：

15、制备纳米粒：取设定量的环糊精固体加入润滑剂后置于胶体磨中研磨一段时间，随后加入药物混合研磨得到药物-环糊精，置于真空环境中挥干润滑剂后利用去离子水溶解药物-环糊精得到混合液，对混合液通过高压微射流均质机以一定均质压力进行均质得到均质溶液，对均质溶液冷冻干燥去除溶剂得到纳米粒；

16、天然提取得到生物膜；

17、制备基于生物膜的双包埋纳米载药系统：将生物膜同纳米粒通过超声振荡的方式混合均匀，随后以氮气为压力源采用高压挤出法挤出，并离心收集底部沉淀得到基于生物膜的双包埋纳米载药系统。

18、在“制备纳米粒”步骤中，取环糊精固体加入乙醇后置于胶体磨中研磨10min，随后加入药物混合研磨20min得到药物-环糊精。在一些实施例中，环糊精固体为β-环糊精固体，药物为视黄醇。另外，为了保证均质均匀，本方案对混合液进行3次均质后采用冷冻干燥机去除溶剂。

19、在一些实施例中，对混合液通过高压微射流均质机以15-25mpa均质压力进行均质得到均质溶液。优选的，可选择为20mpa均质压力。

20、在“天然提取得到生物膜”步骤中，将细菌接种在培养基上进行发酵培养后收集发酵液，对发酵液进行离心获取菌体沉淀后重悬得到含有菌体的溶液，对含有菌体的溶液采用高压微射流均质法进行破碎后得到碎片溶液，将碎片溶液通过固体层析柱进行分离纯化后洗脱得到生物膜。此时，生物膜为细胞质膜囊泡。

21、在一些实施例中，将细菌接种到培养基上进行发酵培养，收集发酵液通过离心获得菌体沉淀，用pbs重悬后，将含有菌体的溶液采用高压微射流均质法进行破碎得到碎片溶液，将碎片溶液采用尺寸排阻色谱法进行分离纯化。本方案利用细胞质膜囊泡粒径小、洗脱速度快的特点，将碎片溶液通过装有琼脂糖或葡聚糖等凝胶基质的固体层析柱，用洗脱液进行洗脱，收集含有细胞质膜囊泡的馏分。

22、在一些实施例中，细菌选自冻干枯草芽孢杆菌粉、冻干乳酸杆菌粉、冻干双歧杆菌菌粉以及冻干嗜热链球菌菌粉的一种。

23、在一些实施例中，将含有菌体的溶液通过高压微射流均质机以25-35mpa均质压力进行均质破碎。优选的，将含有菌体的溶液通过高压微射流均质机以30mpa均质压力进行均质破碎。

24、特别需要强调的是：菌体破碎是影响生物膜提取率的关键步骤，传统的超声破碎法是利用高频率的超声波使样品快速地破碎和分散，存在效率低、成本高、破碎不均匀等问题，而本发明中采用的高压微射流均质法利用高压力将菌体溶液通过特殊结构孔道进行挤压、剪切和撞击，能够解决上述问题，获得更稳定、均一的菌体碎片，这将极大地提高生物膜提取率。且生物膜提取过程中往往含有其他杂质囊泡或干扰蛋白存在，这些杂质会影响到生物膜本身的包裹能力，因此对生物膜生产和测试必须保证高质量的标准，这就需要对生物膜进行分离纯化。传统的分离纯化方法是差速离心法，利用不同物质密度、大小、形状不同，通过变化离心力以分离需求物质，这种方法对仪器要求十分严格，耗时较久，有破坏囊泡完整性的风险，强大的离心力可能会导致干扰蛋白与生物膜发生融合。而本方案采用的尺寸排阻色谱法是基于不同粒径的颗粒通过洗脱液流过多孔聚合物构成固定相的洗脱速度不同而精细地分离出不同粒径的物质。细胞质膜囊泡是一种粒径小的天然囊泡物质，当细胞质膜囊泡通过固体层析柱时，会比其他小分子物质(如蛋白质)先洗脱下来，利用这一特点便可以对细胞质膜囊泡进行分离纯化。尺寸排阻色谱法具有更快的纯化速度，更低的设备成本要求，分离的样品纯度更高，能够保留囊泡结构的完整性，还具有一定的富集作用。

25、在“制备基于生物膜的双包埋纳米载药系统”步骤中，将生物膜用磷酸缓冲液稀释，并同纳米粒通过超声振荡的方式混合均匀，随后以氮气为压力源采用高压挤出法挤出，在4℃下以15000g离心20min，收集底部沉淀得到基于生物膜的双包埋纳米载药系统。

26、第三方面，本方案提供的基于生物膜的双包埋纳米载药系统的应用，可将上述方法制备得到的基于生物膜的双包埋纳米载药系统用于包合药物。

27、相较于现有技术，本方案具有以下特点和有益效果：

28、本方案结合环糊精和生物膜的特点，首先利用环糊精包合药物得到纳米粒以提高药物在体系内的稳定性，随后以天然提取的生物膜包合纳米粒得到基于生物膜的双包埋纳米载药系统，借助生物膜的具有良好的生物相容性、安全性、稳定性、缓释性提高了整个体系的性能，使得基于生物膜的双包埋纳米载药系统解决现有药物存在溶解性、稳定性和生物利用度不足的问题。另外，本方案提供的基于生物膜的双包埋纳米载药系统的制备方法采用高压微射流均质法进行均质，通过旋蒸和冻干制备的环糊精纳米粒为固态形式，具有更高的储存稳定性和载药量。