一种重楼皂苷Ⅶ在制备抗卵巢癌药物中的应用的制作方法

本发明属于重楼皂苷应用，具体涉及一种重楼皂苷ⅶ在制备抗卵巢癌药物中的应用。

背景技术：

1、卵巢癌作为常见的妇科恶性肿瘤，international agency for research oncancer，iarc显示女性生殖系统恶性肿瘤中卵巢癌发病率位列第三，病死率居首位。卵巢癌早期无明显症状且缺乏有效的筛查手段，70％的患者在就诊时已是晚期(ⅲ～ⅳ期)。晚期卵巢癌由于治疗手段限制，其5年生存率低至30％，严重威胁着女性的生命健康。成为困扰着肿瘤医生和妇产科医生的世纪难题。而2014年聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂parpi的问世开启了卵巢癌精准靶向治疗时代，在一定程度上打破了晚期卵巢癌治疗困境这一僵局。由于卓越的疗效，parpi已逐渐占据了卵巢癌维持治疗的舞台，2020年最新版nccn指南已将parpi的推荐范围拓展到所有晚期卵巢癌患者，也是给不存在基因突变的患者带来了更多的临床获益。然而parpi虽然在一定程度上提高了患者的生存期，为晚期卵巢癌的治疗提供了一种治疗选择，但越来越多的患者出现对parpi的原发性或获得性耐药，严重限制了parpi的临床应用。因此，深入探究卵巢癌parpi耐药机制并寻找高效、低毒、广谱的耐药逆转剂已成为当前卵巢癌肿瘤领域研究的重大临床难题。

2、传统中医药在亚洲国家用于肿瘤治疗已有上千年历史，近年来，中医药等天然药物凭借其独特的优势在肿瘤治疗领域的研究得到了越来越多的关注。中医药可以作为辅助治疗手段，与传统的放化疗方法结合使用，有效提高患者的治疗反应和生存率。而在传统中医药研究中，越来越多的中草药有效成分被发现具有抗肿瘤活性。重楼皂苷ⅶ(parissaponinⅶ,psⅶ)是中药重楼的有效活性单体成分，已被发现在多种肿瘤中具有很好的抗肿瘤活性。目前研究发现，重楼皂苷ⅶ可以通过诱导细胞凋亡和抑制增殖在结直肠癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌等可以发挥作用，重楼皂苷ⅱ可以通过促进细胞凋亡、增殖和血管生成等途径抑制卵巢癌的进展。研究发现重楼皂苷ⅶ可以通过抑制糖酵解途径促进卵巢癌细胞凋亡。鉴于糖酵解在耐药中具有的重要调控作用，由此推测重楼皂苷ⅶ可能在卵巢癌中parpi耐药同样具有一定的作用，但其具体作用程度、作用机制及相关靶点目前尚未阐明。

3、对此，发明人提出一种重楼皂苷ⅶ在制备抗卵巢癌药物中的应用，用以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重楼皂苷ⅶ在制备抗卵巢癌药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种重楼皂苷ⅶ在制备抗卵巢癌药物中的应用，包括：

4、s1、细胞培养，从患者组织中获取人卵巢上皮癌细胞(skov3和hey)和人脐静脉内皮细胞(huvec)，其中skov3在rpmi-1640培养基中培养；hey和huvec细胞在改良eagle培养基中培养，细胞在37℃，5％co2环境中培养，并进行rna-seq数据分析，分析耐药与敏感细胞系差异功能，进行糖酵解分析、细胞氧耗率、细胞外酸化率和细胞存活率测定及分析；

5、s2、引物设计，基因引物如下所示：

6、18s rna

7、f:aggaattcccagtaagtgcg

8、r:gcctcactaaaccatccaa

9、进行定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)和西方印迹分析，检测ps vii对耐药细胞相关分子的影响；

10、s3、染色质免疫沉淀，细胞与1％甲醛交联，然后使用甘氨酸消除交联反应，将细胞在含有蛋白酶抑制剂的sds缓冲液中裂解，并进行荧光共振能量转移和荧光寿命成像；

11、s4、质粒构建和病毒感染，利用rorα、ecm1和vegfr2的全长人类cdna序列构建重组质粒；

12、s5、免疫荧光，使用dna染料dapi(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)，将所有细胞染色，使用leica sp5共聚焦荧光显微镜拍摄细胞影像，将人ecm1基因启动子区域克隆到pgl3基本载体中，生成pgl3-ecm1-promoter重组质粒；

13、s6、细胞凋亡分析，将huvec细胞分装入用matrigel包被的24孔细胞培养板中，并用skov3或hey细胞培养基培养4小时，用显微镜观察管状结构的形成，将细胞分散到6孔板中，并在细胞密度达到50％时用sr1078或顺铂进行处理，培养48小时后，将细胞消化并收集到管中；

14、s7、实验验证，包括细胞实验和动物体内实验，报告三次或更多独立实验的均值±sem，得到结果；

15、s8、免疫组织化学，将肿瘤活检标本固定在福尔马林中，包埋在石蜡中并切成5μm厚的切片，然后用脱脂水脱蜡和脱水，随后用去矿化水重新水合，采用免疫组织化学方法利用微波预处理方法提取抗原，并进行免疫沉淀。

16、优选的，s1中细胞培养将hey、skov3细胞培养至达到接近对数生长期(70％至80％的细胞密度)，培养于含有奥拉帕尼的培养基中，起始浓度设置为半抑制浓度值的10％，每2周增加10％奥拉帕尼的浓度，直到细胞完全能够耐受最大剂量，保持用药压力6个月，构建hey、skov3 parpi耐药细胞。

17、优选的，s3中使用total rna isolation kit v2(vazyme)提取组织和细胞rna，并进行实时逆转录聚合酶链式反应，将rorα、ecm1和vegfr2的cdna序列克隆到pcdh-cmv-mcs-ef1-puro慢病毒载体中，生成过表达(oe)重组质粒pcdh/rorαoe、pcdh/ecm1 oe和pcdh/vegfr2 oe，进行携带重组质粒的慢病毒转导，将细胞用1μg/ml的puromycin筛选两周。

18、优选的，s4中进行免疫组织化学染色，使用来自abcam的以下抗体：抗-rorα(ab256799)、抗-ecm1(ab253185)和抗-vegfr2(ab233693)，山羊抗-兔辣根过氧化物酶连接二抗(ab205718,abcam)作为二抗，使用3,3'－二氨基联苯胺反应液原位可视化蛋白，所述免疫沉淀使细胞在ripa裂解缓冲液(beyotime)中裂解。

19、优选的，s5中染色质免疫沉淀中超声处理将染色质dna分为约300个碱基对的片段，然后进行10μg igg(ab172730，abcam)或10μg rorα(ab256799，abcam)的免疫沉淀，用低盐和高盐浓度洗涤缓冲液进行洗涤，然后在高盐条件下去交联dna片段，使用qiaquick pcr纯化试剂盒(vazyme)纯化dna，随后进行实时逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析。

20、优选的，s6中所述荧光共振能量转移和荧光寿命成像将绿色荧光蛋白(gfp)融合到受体蛋白质中，将红色荧光蛋白(rfp)融合到受体蛋白质中，分别由pcmv3-c-gfpspark和cmv3-c-rfpspark载体表达。

21、优选的，s6中所述糖酵解分析使用glucose uptake colorimetric assay kit(biovision)、lactate colorimetric assay kit(biovision)、atp assay kit(sigma-aldrich)和amplite colorimetric nadph assay kit(aat bioquest inc.)，以检查卵巢癌细胞的糖酵解过程。

22、优选的，s6中所述细胞氧耗率和细胞外酸化率将4×104个细胞培养在96孔板中，并孵育过夜，在使用seahorse缓冲液(含有25mmol/l葡萄糖，2mmol/l丙酮酸钠和2mmol/l谷氨酰胺的dmem酚红液)清洗细胞后，自动注入175μlseahorse缓冲液加上25μl每个1mmol/l奥利司他霉素、1mmol/l羧基-三氟甲氧基苯肼(fccp)和1mmol/l罗红霉素来测量ocr，然后，添加25μl每个10mmol/l葡萄糖、1mmol/l奥利司他霉素和100mmol/l 2-脱氧葡萄糖来测量ecar，ocr和ecar值在归一化到细胞数后计算，并绘制为平均值±sem。

23、优选的，s6中所述细胞存活率测定将2×103个细胞分装入96孔板中，添加0.2ml维持培养基评估细胞增殖率，加入细胞计数试剂盒-8(cck8)(topscience)(8％)，孵育1.5小时，在6小时、24小时、48小时和72小时点测量细胞存活率，通过微孔读板仪(synergy h4,bio-tek)在450nm处吸光度测量，表示细胞数目。

24、优选的，s8中细胞实验包括克隆形成实验、划伤愈合实验、transwell迁移和侵袭实验以及管状结构形成实验。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、本发明发现psⅶ一定程度上逆转卵巢癌parpi耐药，并与parpi联用在卵巢癌治疗中发挥更好的协同治疗作用，其潜在功能可能通过阻碍卵巢癌parpi耐药细胞糖酵解和血管生成，这与psⅶ结合并稳定rorα表达，并进一步抑制ecm1同时阻碍vegfr2/fak/akt/gsk3β信号通路相关。上述研究数据为临床卵巢癌治疗提供了一种新的靶向治疗方案，并为卵巢癌parpi耐药患者带来了一线希望，有效拓宽了parpi在临床治疗中的应用。