一种嵌入式人工真皮及其制备方法与流程

本发明属于仿生材料，具体涉及一种嵌入式人工真皮及其制备方法。

背景技术：

1、真皮替代物是基于组织工程学发展起来的创面修复医用材料，临床上常用的真皮替代物包括天然真皮替代物和人工真皮替代物两种。目前，国际首个商品化人工真皮替代物自1996年首次被fda批准用于烧伤创面治疗以来，现已广泛应用于全层皮肤缺损的修复及重建。该类真皮替代物通过冷冻干燥成型，为三维贯通多孔支架结构，利于细胞长入。但贯通的孔结构也利于支架与创面渗液充分接触，支架通常整体溃散降解，降解偏快，且降解过程中力学性能不足，支架易失去模板支撑作用，不能很好地抑制肌成纤维细胞定向排列及密集增殖，从而导致术区瘢痕增生。而天然真皮替代物通过脱细胞工艺制备得到，结构较为致密，孔隙率低，孔径尺寸小，不利于细胞长入，但这种致密结构通常使支架由外到里逐步降解，降解过程中仍能很好地维持支架模板功能。因此，优化支架的孔结构，调节支架的降解周期，并维持支架降解过程中的模板支撑作用，对真皮再生修复早期细胞的长入、远期抑制瘢痕增生具有重要作用。

2、cn104474589a专利公开了一种双层结构的引导组织再生膜，一层由降解时间较长的生物纤维制得的致密层，另一层由降解时间不同的生物纤维混合制得的潜在疏松层。该再生膜通过静电纺丝技术制备，用于全层皮肤缺损修复时，存在厚度不足、支架结构整体较为致密，不利于细胞纵向长入并重建足够厚度的新生真皮层的目的。

3、cn208552592u专利公开了一种三层结构的仿生人工皮肤，由脱细胞基质外膜层、纳米复合纤维层及海绵层组成，该技术主要解决的是创面皮肤组织渗液吸收的问题，提高植皮成活率。

4、cn108853590a提供了一种具有抗菌抑菌作用的人工真皮，该人工真皮为三层结构，自上而下依次为硅胶层、抗菌抑菌层以及胶原层，其中，抗菌抑菌层为厚度为1-1.5mm的phmb水凝胶层，由于phmb具有较强的抗菌能力，且临床菌株对phmb的敏感性较高，是赋予人工真皮持续抗菌的合适抗菌成分。该技术主要是赋予人工真皮移植后抗菌及预防感染的作用。

5、众所周知，人工真皮替代物移植时通常需要两期手术，一期先移植人工真皮，待真皮支架全层血管化后二期再移植自体皮封闭创面，两期手术给患者带来巨大痛苦，延长了患者住院周期，并增加手术费用。对于一些缺损面积较小的创面，临床上也多让创面自行上皮化，减少二期手术的必要性，但通常自行上皮化封闭创面时间较长，1个月至3个月不等。而表面粗糙的致密外层，利于创面周围表皮细胞快速迁移，最终可缩短创面愈合的时间。一期手术后，患者只需门诊换药即可，但对创面湿润保持及感染预防也提出了更高的要求。

6、因此，开发一种多功能的嵌入式人工真皮，可以克服现有人工皮肤真皮层降解机理单一不能很好地抑制瘢痕增生，表皮层结构和功能不利于创面自行上皮化等问题，是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌入式人工真皮及其制备方法，该人工真皮可以克服现有人工皮肤真皮层降解机理单一不能很好地抑制瘢痕增生，表皮层结构和功能不利于创面自行上皮化等问题。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种嵌入式人工真皮，所述嵌入式人工真皮包括脱细胞基质表层、胶原海绵支架层；

4、所述胶原海绵支架层中嵌有脱细胞基质中间层。

5、优选地，所述胶原海绵支架层的体内降解周期天数t1≤28天，例如可以为27天、25天、23天、21天、19天、17天、15天、13天、11天、9天、7天、5天等。

6、优选地，所述脱细胞基质中间层的体内降解周期天数t2＞28天，例如可以为29天、31天、45天、60天、90天、120天、150天、180天等。

7、优选地，所述脱细胞基质表层的体内降解周期天数t3，t1≤t3＜t2。

8、优选地，所述脱细胞基质表层的密度为100-250mg/cm3，例如可以为110mg/cm3、120mg/cm3、130mg/cm3、140mg/cm3、150mg/cm3、160mg/cm3、170mg/cm3、180mg/cm3、190mg/cm3、200mg/cm3、210mg/cm3、220mg/cm3、230mg/cm3、240mg/cm3、250mg/cm3等。

9、优选地，所述脱细胞基质中间层的密度为120-300mg/cm3，例如可以为130mg/cm3、140mg/cm3、150mg/cm3、160mg/cm3、170mg/cm3、180mg/cm3、200mg/cm3、220mg/cm3、240mg/cm3、260mg/cm3、280mg/cm3等。

10、优选地，所述胶原海绵支架层的孔径为15-500μm(例如可以为16μm、18μm、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm、200μm、300μm、400μm、450μm等)，孔隙率≥90％(例如可以为92％、94％、96％、98％、99％等)，密度5-15mg/cm3(例如可以为6mg/cm3、8mg/cm3、10mg/cm3、12mg/cm3、14mg/cm3等)。

11、优选地，所述脱细胞基质表层和脱细胞基质中间层的厚度各自独立地为0.1-0.7mm，例如可以为0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm等。

12、优选地，所述胶原海绵支架层的厚度为0.7-2.5mm，例如可以为0.8mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm等。

13、第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌入式人工真皮的制备方法，所述制备方法包括：

14、(1)将脱细胞基质打孔后进行化学交联，得到脱细胞基质中间层；

15、(2)将脱细胞基质表层展平于模具底部，加入胶原复合液，冷冻后，得到表层-海绵结构；

16、(3)将步骤(1)制得的脱细胞基质中间层平铺于所述表层-海绵结构上方，再加入胶原复合液，静置溶融，冷冻干燥，真空高温处理，得到所述嵌入式人工真皮。

17、步骤(1)、步骤(2)先后顺序不做限定。

18、优选地，所述脱细胞基质的制备原料包括猪腹膜、猪皮或猪小肠黏膜下层中的任意一种。

19、优选地，所述脱细胞基质打孔的孔形状包括圆形、椭圆形、正方形或长方形中的任意一种或至少两种的组合。

20、优选地，所述脱细胞基质打孔的孔边缘最长两点的距离为2-12mm(例如可以为3mm、5mm、7mm、9mm、11mm等)，邻近孔的孔心间距为3-20mm(例如可以为4mm、6mm、8mm、10mm、12mm、14mm、16mm、18mm等)。

21、优选地，所述化学交联采用的交联剂包括京尼平、甲醛、戊二醛、碳二亚胺-琥珀酰亚胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或原花色素中的任意一种。

22、优选地，所述胶原复合液包括胶原成分、第二组分和第三组分。

23、优选地，所述胶原成分包括i型胶原、ii型胶原或iii型胶原中的任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，所述第二组分包括弹性蛋白、硫酸软骨素或透明质酸中的任意一种或至少两种的组合。

25、优选地，所述第三组分包括乙酰化白芨多糖、硫酸乙酰化白芨多糖、海藻多糖、黄芪多糖、β-葡聚糖或壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合。

26、优选地，所述胶原成分、第二组分和第三组分的质量比为(80-95):(2.5-15):(0.5-8)，例如可以为80:3:0.5、80:3:1、80:3:2、80:3:3、80:3:4、80:3:5、80:3:6、80:3:7、80:3:8、85:4:0.5、85:4:1、85:4:2、85:4:3、85:4:4、85:4:5、85:4:6、85:4:7、85:4:8、90:6:0.5、90:6:1、90:6:2、90:6:3、90:6:4、90:6:5、90:6:6、90:6:7、90:6:8、95:10:0.5、95:10:1、95:10:2、95:10:3、95:10:4、95:10:5、95:10:6、95:10:7、95:10:8等。

27、优选地，所述胶原复合液中可溶性固形物的质量百分含量为0.25-0.8％，例如可以为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％等。

28、本发明在胶原海绵支架层中加入第二组分和第三组分，有效促进生长因子的调控和富集，促进支架快速血管化，并具有抗菌或抑菌、消炎的作用，利于创面愈合。

29、本发明人工真皮的胶原海绵支架层为疏松多孔结构，可根据实际应用时降解时间的需要进行轻微交联或者不进行交联。

30、优选地，步骤(1)、步骤(2)中，所述脱细胞基质表层和脱细胞基质中间层均为粗糙化表面。

31、本发明采用的脱细胞基质表层的粗糙表面利于创面周围表皮细胞快速黏附、增殖和迁移，从而利于创面自行上皮化封闭，无需二次植皮可缩短创面愈合时间。

32、优选地，所述冷冻的温度为-80～-20℃(例如可以为-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃等)，时间为0.8-3h(例如可以为0.9h、1h、1.1h、1.5h、2h、2.5h、2.8h等)。

33、优选地，所述静置溶融的时间为5-15min，例如可以为6min、8min、10min、12min、14min等。

34、优选地，所述高温真空处理的温度为105-120℃(例如可以为106℃、108℃、110℃、112℃、114℃、116℃、118℃等)，压力≤-0.01mpa(例如可以为-0.03mpa、-0.05mpa、-0.1mpa等)，时间为20-48h(例如可以为20h、24h、36h、46h等)。

35、优选地，所述制备方法包括：

36、(1)将脱细胞基质打孔，孔的形状包括圆形、椭圆形、正方形或长方形中的任意一种或至少两种的组合，孔的边缘最长两点的距离为2-12mm，邻近孔的孔心间距为3-20mm，然后进行化学交联，采用的交联剂包括京尼平、甲醛、戊二醛、碳二亚胺-琥珀酰亚胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或原花色素中的任意一种，得到脱细胞基质中间层；

37、(2)将脱细胞基质表层展平于模具底部，加入胶原复合液，冷冻后，得到表层-海绵结构；

38、步骤(1)、步骤(2)先后顺序不做限定；

39、所述脱细胞基质表层和脱细胞基质中间层均为粗糙化表面；

40、(3)将步骤(1)制得的脱细胞基质中间层平铺于所述表层-海绵结构上方，再加入胶原复合液，静置溶融、冷冻干燥后，于105-120℃、压力≤-0.1mpa下真空高温处理20-48h，得到所述嵌入式人工真皮；

41、步骤(2)、步骤(3)中所述胶原复合液包括胶原成分、第二组分和第三组分，其中，胶原成分包括i型胶原、ii型胶原或iii型胶原中的任意一种或至少两种的组合，第二组分包括弹性蛋白、硫酸软骨素或透明质酸中的任意一种或至少两种的组合，第三组分包括乙酰化白芨多糖、硫酸乙酰化白芨多糖、海藻多糖、黄芪多糖、β-葡聚糖或壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合；

42、所述胶原成分、第二组分和第三组分的质量比为(80-95):(2.5-15):(0.5-8)；

43、所述胶原复合液中可溶性固形物的质量百分含量为0.25-0.8％。

44、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

45、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

46、(1)本发明提供的嵌入式人工真皮为三层结构紧密结合，脱细胞基质中间层可实现在体内由外到里逐步降解，能很好地发挥藤索牵引功能，抑制肌成纤维细胞定向排列及密集增殖，从而抑制瘢痕增生；

47、(2)脱细胞基质表层为表面粗糙的致密结构，致密结构可提供物理屏障作用，抵御微生物入侵，防止水分蒸发；粗糙表面利于创面周围表皮细胞快速黏附、增殖和迁移，从而利于创面自行上皮化封闭，无需二期手术植皮，可缩短创面愈合时间；

48、(3)胶原海绵支架为三维多孔结构，生物相容性好，可在体内较快降解，利于纤维母细胞和毛细血管从创面基底和周边组织快速长入，缩短支架血管化进程；进一步地，胶原海绵支架层中第二组分和/或第三组分的加入，可促进生长因子的调控和富集，促进支架快速血管化，并具有抗菌或抑菌、消炎的作用，利于创面愈合。