一种多重生物学效应肿瘤治疗用超小钴单原子纳米催化材料及其制备方法和应用

本发明涉及一种具有高生物相容性、稳定性和体内安全性的基于特异性靶向损伤细胞线粒体并抑制其保护性自噬的钴单原子纳米催化材料及其作为低毒、高效特异性肿瘤治疗用纳米材料的相关应用，属于生物医药领域。

背景技术：

1、基于纳米材料的精准医学和个性化医疗的发展为纳米催化医学的肿瘤干预提供了新的思路：靶向癌细胞亚细胞器。针对亚细胞器的治疗策略集中于对特定细胞器进行高敏感度和精准打击，近几年来受到越来越多的研究关注。通过定制化的设计与特定的修饰，细胞器靶向纳米催化剂在肿瘤细胞内富集，经内吞作用跨越细胞屏障并靶向目标亚细胞结构，在靶标位置催化特定的反应，从而提高其抗肿瘤效率，降低毒副作用。因此，针对亚细胞器的靶向策略在克服生理和病理屏障、降价治疗阈值剂量、减少毒副作用、克服多药耐药性等问题上具有巨大的潜力，最终达到提高高效治疗肿瘤的目的。

2、线粒体通常被认为是细胞内活性氧物质产生的主要场所。线粒体活性氧物质的产生是由线粒体内呼吸过程中的电子传递链发生泄漏导致的。当线粒体内的电子传递链遇到障碍时，更多的电子会从呼吸链中逸出并与氧分子结合，产生更多的活性氧物质，如超氧阴离子等。此外，线粒体的膜电位也可以调节活性氧物质的产生。当线粒体膜电位降低时，电子的泄漏率会增加，从而增加活性氧物质的产生。线粒体氧化还原稳态，即活性氧物质和谷胱甘肽等抗氧化剂之间的平衡，在许多生物过程维持过程中起着关键作用，包括生物合成和细胞凋亡。许多异常增殖性癌细胞的特征是活性氧物质水平高于肿瘤细胞的抗氧化水平。高水平的氧化应激使癌细胞更容易受到外源性物质的影响，这可能导致肿瘤氧化还原稳态的破坏。因此，线粒体氧化还原稳态是癌症治疗的潜在目标，线粒体氧化水平的提高导致活性氧物质快速积累，从而引发细胞凋亡。

3、纳米催化医学的其中一种治疗策略是在肿瘤部位特异性催化氧自由基的产生，破坏癌细胞氧化还原平衡，造成氧化应激和脂质过氧化。经过多年的发展，纳米催化医学介导的氧化损伤策略得到了广泛的认可与验证。然而，肿瘤细胞特异性氧化损伤策略会激活肿瘤细胞自身的抗氧化机制和保护性自噬，这两种保护性应激反应对肿瘤治疗的效果产生影响。

技术实现思路

1、为了解决肿瘤治疗时细胞抗氧化机制和保护性自噬行为对肿瘤治疗效果产生的不利影响，本发明提供了一种可抑制自噬、且具有线粒体靶向性能的超小钴单原子纳米催化材料及其制备方法和应用，其制备方法简单、颗粒分散性良好、粒径均一、生物安全性高。

2、第一方面，本发明提供了一种超小钴单原子纳米催化材料，包括：co-c-n纳米材料，修饰在co-c-n纳米材料表面的聚合物，以及嫁接在co-c-n纳米材料和聚合物表面的线粒体靶向功能基团；所述co-c-n纳米材料中co元素以co单原子形式分布在c-n骨架中，且co-c-n纳米材料表面具有多孔孔道。其中，聚合物与纳米催化剂表面的疏水区域通过物理吸附，形成稳定的聚合物壳层；线粒体靶向基团与表面聚合物发生化学反应，形成共价建连接。

3、本发明中，采用生物相容性的聚合物对co-c-n进行表面修饰，该改性方法既能提高纳米催化剂的生物相容性和稳定性，又能为具有线粒体靶向作用的功能基团的嫁接提供位点。本发明中所得超小钴单原子纳米催化材料具有亲水性和线粒体靶向性。

4、较佳的，所述co-c-n纳米材料具备均质的十二面体结构，平均粒径为19～50nm；所述co-c-n纳米材料表面具有多孔孔道结构，平均孔道直径为0.5～6nm，比表面积为500～1200m2/g；优选，平均孔道直径为1～3nm，比表面积为800～1000m2/g；更优选，平均孔道直径为1.223nm，比表面积为845.952m2/g。本发明中，所述超小钴单原子纳米催化剂表面粗糙，呈现出多孔的形貌，能够高效负载药物，例如氯喹。所述超小钴单原子纳米催化材料能够催化h2o2生成超氧阴离子，从而针对性对破坏肿瘤线粒体电子传递链，达到氧化损伤肿瘤细胞线粒体的目的。

5、较佳的，所述co-c-n纳米材料中co元素的原子百分比为0.32～0.6at％，c元素的原子百分比为82.32～89.42at％，n元素的原子百分比为9.98～11.27at％，总原子百分比之和为100％。

6、较佳的，所述聚合物为亲水性聚乙二醇，更优选为二硬脂酰磷脂醇-聚乙二醇-氨基(dspe-peg-nh2)；

7、所述聚合物和co-c-n纳米材料的投料质量比为(1～10)：1，得到产物co-c-n-nh2；

8、所述线粒体靶向功能基团为三苯基膦(tpp)，与聚合物酰胺缩合反应形成酰胺键；

9、所述线粒体靶向功能基团和co-c-n-nh2的比为1：(0.5～1)。

10、较佳的，还包括负载在所述co-c-n纳米材料表面具有多孔孔道中的药物；所述药物为自噬抑制药物，优选为线粒体自噬抑制剂，更优选为氯喹；

11、所述药物的负载量不超过10wt％，优选为9.48wt％。

12、在发明中，超小钴单原子纳米催化材料靶向性氧化损伤细胞线粒体电子传递链蛋白，放大线粒体氧化应激反应，诱导线粒体损伤，同时释放出氯喹抑制线粒体保护性自噬，造成线粒体功能紊乱和受损线粒体在细胞内堆积，杀伤肿瘤细胞。

13、第二方面，本发明提供了一种超小钴单原子纳米催化材料的制备方法，包括：

14、(1)将含钴的zif-8有机金属框架材料前驱体在保护气体中炭化处理，得到co-c-n纳米材料(或称氮掺杂碳载体的钴团簇，co-clusters ncs)；

15、(2)将聚合物和co-c-n纳米材料在惰性气体保护下，经过搅拌和旋蒸，制备得到表面含活性基团的co-c-n纳米材料

16、(3)将具有线粒体靶向性能的有机基团嫁接于表面含活性基团的co-c-n纳米材料表面，得到所述超小钴单原子纳米催化材料。

17、较佳的，步骤(1)中：所述炭化处理的温度为800～1000℃；所述炭化处理的时间为1～4小时；

18、所述保护气体为惰性气体或/氮气；所述惰性气体为氩气；所述保护气体的纯度为95％以上。

19、较佳的，步骤(2)中，所述聚合物和co-c-n纳米材料的质量比为(1～10)：1；

20、所述保护气体为惰性气体或/氮气；所述惰性气体为氩气；所述保护气体的纯度为95％以上；

21、所述搅拌的转速为200～500rpm，搅拌的时间为1～2小时；

22、所述旋蒸的温度为80～95℃，旋蒸的转速为50～160rpm，时间为1～2小时。

23、较佳的，所述制备方法还包括：将步骤(3)所得超小钴单原子纳米催化材料和药物在极性有机溶剂中搅拌，实现药物的负载，再经真空旋蒸；

24、优选地，所述极性有机溶剂为氯仿、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺中的一种；

25、优选地，所述真空旋蒸的温度为60～80℃；

26、优选地，所述搅拌的转速为200～500rpm，时间为2～6h。

27、较佳的，所述含钴的zif-8有机金属框架材料前驱体co@zif-8的制备方法包括：

28、将有机配体溶解在有机溶剂中，形成a液；

29、将锌盐与钴配位化合物分别溶解在同种有机溶剂中，形成b液；

30、将a液与b液混合，于50～60℃温度下以400～500rpm的转速搅拌6～12小时，得到含钴配位化合物的zif-8有机金属框架材料；

31、将所得含钴配位化合物的zif-8有机金属框架材料和有机配体混合搅拌均匀，置于高压反应釜在120～140℃下反应4～6小时，得到含钴的zif-8有机金属框架材料前驱体co@zif-8。

32、又，较佳的，所述有机配体为二甲基咪唑；

33、所述有机溶剂为甲醇、乙醇中的至少一种；

34、所述锌盐为乙酸锌、醋酸锌；

35、所述含钴配位化合物为乙酰丙酮钴(co(acac)3)；

36、优选地，所述锌盐和钴配位化合物的质量比可以为1：(1～2)。

37、第三方面，本发明提供了一种超小钴单原子纳米催化材料注射液，其特征在于，包括：生物相容性溶液、以及分散于生物相容性溶液中的上述超小钴单原子纳米催化材料。其中，所述的钴单原子纳米催化材料具有线粒体靶向性、催化氧化性能和抑制线粒体自噬性能。

38、较佳的，所述超小钴单原子纳米催化材料注射液的浓度为2～1000μg/ml，优选为100～400μg/ml。

39、较佳的，所述生物相容性溶液为生理盐水或磷酸盐缓冲液。

40、较佳的，所述生理盐水中溶质含有nacl，浓度为0.9wt％。所述磷酸盐缓冲液通过商业购买所得。

41、第四方面，本发明提供了，一种超小钴单原子纳米催化材料或超小钴单原子纳米催化材料注射液在制备低毒、高效肿瘤治疗用药物中的应用。在本公开中，所述的超小钴单原子纳米催化材料可以负载氯喹到达肿瘤细胞线粒体电子传递链附近，产生活性氧物质从而氧化损伤线粒体etc上的蛋白，放大肿瘤细胞线粒体上的氧化应激反应，造成线粒体功能紊乱，同时释放出氯喹抑制受损线粒体通过保护性自噬清除，二者协同作用达到加速肿瘤细胞死亡的目的。所述纳米催化材料在体内外抑制肿瘤生长中具有明显效果。构建裸鼠的皮下瘤模型，将荷瘤鼠随机分为六组：对照组(注射生理盐水)、氯喹组、纳米催化剂组、靶向线粒体的纳米催化剂组、负载氯喹的纳米催化剂组、靶向线粒体且负载氯喹的纳米催化剂组。当移植瘤的体积达到100mm3时，我们通过尾静脉注射100μl的药物，剂量60mg kg-1，第7天以同样的剂量进行二次给药。每两天观察裸鼠的健康状况并采集裸鼠体重和肿瘤体积数据。根据肿瘤体积变化曲线和肿瘤抑制率曲线可发现，单独的氯喹或纳米催化材料对肿瘤的抑制作用并不明显，靶向线粒体的纳米催化剂组和负载氯喹的纳米催化剂组对肿瘤的增殖有轻微的抑制作用，相对抑制率分别为54.76％和56.17％，而靶向线粒体且负载氯喹的纳米催化剂组的肿瘤抑制率达到了69.92％，充分突出了线粒体靶向的催化氧化结合线粒体自噬抑制治疗策略的协同作用效应。

42、本发明的有益效果：

43、本发明中超小钴单原子纳米催化材料的优点在于：(1)靶向性氧化损伤肿瘤线粒体，放大线粒体氧化应激反应，造成线粒体功能紊乱，同时抑制细胞自噬对受损线粒体的清除，诱导细胞凋亡。(2)具有高亲水性，极易溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，可直接临床使用，不需要增溶剂。(3)本发明中超小钴单原子纳米催化材料工艺简单、成本低、易于批量化生产、治疗效果好，具有广阔的应用前景。