一种尼古丁蛋白缀合物、其制备方法及在疫苗中的应用

本发明属于免疫，具体涉及一种尼古丁蛋白缀合物、其制备方法及在疫苗中的应用。

背景技术：

1、尼古丁是烟草中的主要成分，也是导致吸烟者成瘾的关键因素。据世界卫生组织估计，每年有超10亿人吸烟成瘾，500万人死于烟草相关疾病，且死亡人数逐年攀升，吸烟是所有可预防性死亡原因中占比最高的，其可以引起多种疾病，如肺癌、呼吸系统疾病、心脏疾病、生殖系统疾病等。即使在无烟烟草中也含有大量尼古丁，若长期使用，也会导致尼古丁成瘾。尽管众所周知吸烟有害健康，但由于它的成瘾性，导致使用者无法停止吸烟，而且若因戒烟突然停用还会出现一系列戒断综合症。

2、目前美国食品药品管理局已批准了6种戒烟药物，其中有5种是尼古丁替代产品（口香糖、贴片、含片、鼻喷雾剂和吸入剂），每种药物都能释放尼古丁，因为尼古丁是导致烟草依赖的因素，所以在某种程度上，可以让人在戒烟时减少尼古丁戒断症状和对香烟的渴望。其他一些预防烟草使用的方法包括非尼古丁治疗（安非他酮、伐伦克林）和其他药物（可乐定、去色氨酸）。然而，目前的药物和非药物戒烟治疗效果有限，并没有广泛推广到广大吸烟者群体（solberg et al., 2001; thorndike et al., 1998）。尽管近些年人们在行为和药物治疗方面取得了进展，但绝大多数试图戒烟的吸烟者都失败了（maurer et al.,2005）。对大多数吸烟者来说，戒烟不仅仅是选择的问题，而是一种斗争。烟草的使用通常与日常生活交织在一起，在生理、心理和社会方面都有强化作用，包括媒体的报道，烟草使用的文化和社会方面在内的许多因素，加上烟草的成瘾性，使戒烟变得困难。

3、尼古丁成瘾机制的核心在于其作用于大脑中的神经递质系统，尤其是作用于多巴胺系统。当尼古丁进入大脑时，它会与神经元表面的尼古丁型乙酰胆碱受体（nachrs）结合（benowitz, 1996）。这些受体在大脑中广泛分布，参与多种生理功能。当尼古丁与nachrs结合时，导致钠离子和钙离子通道打开，神经元膜去极化并产生动作电位，从而导致神经递质的释放。尼古丁对多巴胺系统的影响在成瘾机制中起着关键作用。尼古丁会刺激大脑奖赏回路中的多巴胺释放，特别是在腹侧被盖区（vta）和核壳体（nac）这两个关键区域。尼古丁不只刺激多巴胺分泌，也抑制单胺氧化酶b，这对多巴胺的分解代谢很重要，导致吸烟者的平均多巴胺浓度远高于不吸烟者（cerny and cerny, 2009）。多巴胺在奖赏和快感方面具有重要功能，当多巴胺水平上升时，会产生愉悦感。吸烟者在吸烟时体验到的愉悦感使他们更容易产生成瘾行为。

4、长期吸烟可能导致大脑神经适应性变化，例如nachrs的表达和功能调节、多巴胺受体敏感性降低等。这些变化会使个体对尼古丁产生耐受性，需要更多的尼古丁来获得相同的愉悦感，从而加剧成瘾行为。同时，戒烟时，多巴胺水平下降可能导致戒断症状，如焦虑、抑郁和烦躁，这使得戒烟变得更加困难。

5、尼古丁疫苗主要功效在于让吸烟者感受不到尼古丁带来的愉悦感。其作用机制是基于尼古丁分子通过肺部进入人体后，抗尼古丁抗体与尼古丁分子结合，抗体分子覆盖尼古丁分子，使尼古丁与其受体的结合受损或不再可能。引起特定免疫反应的分子的最小分子量是10kda，而尼古丁分子太小（分子量为167 da），无法引起免疫反应，因此，经常吸烟的人对其没有产生抗体。尼古丁疫苗是通过将尼古丁分子本身或结构相关的半抗原与免疫原性载体蛋白结合，形成具有免疫原性的免疫原。这种基于抗体结合药物的设计首先在海洛因成瘾的动物模型上进行了测试，随后在其他滥用药物上进行了推广，包括吗啡、甲基苯丙胺、苯环利定、可卡因和尼古丁等（raupach et al., 2012）。

6、在尼古丁疫苗研究方面，目前已进入临床前的尼古丁疫苗主要有以下几种，且它们都由偶联物与佐剂组成。其中尼古丁与一种载体蛋白相连，使其在免疫系统中可识别并引起免疫反应，佐剂则可增强针对尼古丁的抗体产生。

7、第一种疫苗为ta-nic，它由xenova开发，现在由英国celtic制药公司投资，该疫苗是在尼古丁的n1位置连上叔丁酸，使用重组霍乱毒素-b亚单位作为尼古丁疫苗的载体蛋白，通过几次不同的实验已证明了其在戒烟方面的有效性，但还有几项实验结果目前尚未公布。

8、第二种疫苗为nic-qb（nic002），此种疫苗由cytos公司开发，它是将病毒样颗粒（vlp）作为载体蛋白，并将尼古丁吡咯烷环上的3'位偶联到噬菌体qβ的病毒样颗粒上，噬菌体q β的外壳蛋白通过在大肠杆菌中进行重组表达，180个亚基自组装形成高度有序的vlp，直径约为25-30 nm，由于vlp上重复出现的抗原提呈和t辅助细胞表位的存在，使得基于q β的疫苗具有较强的免疫原性，在一次免疫接种后即可在人类中实现100%的反应率。在nic-qb疫苗中，大约每个q β vlp上共价偶联了585个尼古丁分子。

9、第三种疫苗为nicvax，该尼古丁疫苗由nabi制药公司开发，利用尼古丁的3'位修饰的氨基和丁二酸酐修饰的铜绿假单胞菌外蛋白a在edc缩合剂下得到蛋白耦联物。在大鼠模型中注射该疫苗，可诱导高滴度的尼古丁特异性抗体，降低尼古丁分布到大脑的程度，减轻尼古丁对生理和行为的影响。此外人体试验显示，尼古丁疫苗是安全的，并具有良好的耐受性。疫苗的免疫原性与剂量相关，最高剂量在预期效力范围内引起抗体水平升高。nicvax的两项iii期临床试验尚未发表，尽管第一和第二阶段试验取得了成功，但这两项试验都未能显示疫苗与对照组的疗效。

10、第四种疫苗为niccine，是由瑞典独立制药公司开发的一种疫苗，它是对尼古丁的6位进行修饰后与破伤风类毒素进行耦联，目前针对该疫苗的临床前研究结果尚未披露。但tonstad等人对其进行了一项ii期试验，旨在评估niccine对吸烟复发的预防效果。结果表明，niccine对于防止吸烟复发效果不明显，且对于戒断症状、呼出一氧化碳水平、复发时间和戒断成功率也没有影响。

11、在目前已报道的和已进入临床试验的尼古丁疫苗中，尼古丁半抗原与载体蛋白的耦联通常采用缓冲液中的直接缩合反应。然而，在缓冲液中进行的耦联反应通常需要几天的时间，且蛋白质构象发生变化后容易沉淀或交联。此外，耦联反应是利用蛋白质上的氨基或羧基位点进行耦联，因此位点随机性较高，难以进行精确控制。

技术实现思路

1、本发明提供了一种在有机溶剂中进行蛋白质载体与半抗原耦联的新方法，利用蛋白质本身的二硫键，通过加入还原剂断裂二硫键暴露出巯基，将尼古丁半抗原上修饰上马来酰亚胺基团。利用巯基与马来酰亚胺的点击反应构建以蛋白质为载体的尼古丁蛋白缀合物，从而为尼古丁疫苗的制备奠定基础。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种尼古丁蛋白缀合物的制备方法，步骤如下：

4、将载体蛋白溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，涡旋超声至无大颗粒，加水，继续超声至无颗粒；然后加入乳化剂和还原剂，室温搅拌；待搅拌均匀后，加入抗原，室温搅拌反应；待反应结束后，加入pbs缓冲液，降低n,n-二甲基甲酰胺的浓度；将反应液离心，获得尼古丁蛋白缀合物。

5、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，各原料选自如下份量数：

6、载体蛋白1~5mg、n,n-二甲基甲酰胺0.5~2ml、水50~200μl、乳化剂0.5~2μl、还原剂1~3μl、抗原1~6mg。

7、在实际应用中，可根据实际规模按照上述份量数比例对各原料的用量进行扩大或缩小。

8、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，所述载体蛋白选自冻干的载体蛋白；所述蛋白选自crm197蛋白或bsa蛋白。

9、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，所述乳化剂选自吐温；优选为吐温-20。

10、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，所述还原剂为三甲基磷。

11、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，所述抗原选自尼古丁、尼古丁半抗原1、尼古丁半抗原2或尼古丁半抗原3；优选为尼古丁半抗原2。

12、上述尼古丁半抗原1的结构如下：

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14、上述尼古丁半抗原2的结构如下：

15、

16、上述尼古丁半抗原3的结构如下：

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18、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，pbs缓冲液选自浓度为50mm，ph 6.5的pbs缓冲液。

19、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，加入pbs缓冲液后，使n,n-二甲基甲酰胺的浓度降低到5%以下。

20、在上述尼古丁蛋白缀合物的制备方法中，室温搅拌的时间选自0.5~5h。

21、本发明提供了由上述方法制备的尼古丁蛋白缀合物。

22、本发明提供了上述尼古丁蛋白缀合物在制备戒烟疫苗中的应用。

23、本发明提供了一种尼古丁疫苗，所述疫苗含有上述尼古丁蛋白缀合物；还可含有制备疫苗所需的其它组分，例如生理盐水、中性脂质体等。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明提供了一种在有机溶剂中进行蛋白质载体与半抗原耦联的新方法，利用蛋白质本身的二硫键，通过加入还原剂（三甲基磷）断裂二硫键暴露出巯基，将尼古丁半抗原上修饰上马来酰亚胺基团，然后利用巯基与马来酰亚胺的点击反应构建以蛋白质为载体的尼古丁蛋白缀合物。本发明采用点击化学的手段来优化耦联步骤，可以开发尼古丁疫苗。点击化学具有特异性高、反应速率快、反应条件耐受性宽、反应成分生物相容性高、可选择的反应类型多等优点。在该方法中，蛋白质构象将变得更灵活，更容易被抗原呈递细胞（apc）获取，从而使制备的尼古丁疫苗具有更高的抗体滴度。