一种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束及其制备方法和应用

本发明属于生物医药领域，具体地说是一种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束及其制备方法和应用。

背景技术：

1、结直肠癌是高居全球死亡率第二的常见癌症，一线化疗效果不佳且易耐药，新兴免疫治疗响应率低，亟需探索有效的靶向治疗策略。大量研究表明：β-catenin和stat3的共同高表达和异常累积是结直肠癌发生发展及转移的关键驱动因素，直接抑制β-catenin和stat3被视为最有效的治疗策略之一，但如何实现该双靶点的高效调控是结直肠癌治疗的前沿难点。另外，结直肠癌中β-catenin和stat3的共同过表达与肿瘤免疫抑制微环境的形成紧密相关。β-catenin水平的上调减少了树突状细胞在肿瘤中的浸润，stat3可抑制细胞毒性t细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。因此，在结直肠癌中同时抑制β-catenin和stat3具有与肿瘤免疫疗法相协同的巨大潜力。

2、蛋白降解靶向嵌合物(protac)是一种用于靶向降解致病蛋白的新型策略，已被广泛应用于抗肿瘤新药的研发。使用protac策略开发靶向β-catenin和stat3的新型药物能够克服抑制剂面临的挑战，具有重大应用前景。其中，相对小分子protac，基于多肽的protac具有易于设计、合成、特异性强、结合面积大和生物安全性高的优势，然而多肽药物在生理环境下易被降解，限制了其体内应用。

3、基于纳米递送系统的癌症治疗策略能够改善药物体内稳定性和生物分布。同时，相对于正常组织，肿瘤微环境具有高还原性的特点，其能够被纳米递送系统利用，实现药物的肿瘤特异性释放。肿瘤微环境中的还原剂谷胱甘肽分布广泛且浓度较大，肿瘤细胞内的谷胱甘肽水平可达细胞外基质的100-1000倍，是正常组织的7-10倍。将药物与胶束材料通过二硫键连接能够实现药物在肿瘤胞内的选择性释放，减少全身毒副作用，实现疗效的增强。因此，本发明基于靶向β-catenin和stat3的多肽protac，设计构建具有还原响应性的自组装胶束，该胶束能够在体内长效循环，并特异性蓄积在结直肠癌肿瘤部位，在谷胱甘肽的条件下释放多肽protac，实现β-catenin和stat3的双重降解，同时调节肿瘤免疫抑制微环境，高效抑制结直肠癌的体内生长。目前还未见类似的报道。

4、dspe-peg2000-sh是一种由脂质dspe、聚乙二醇peg2000和巯基sh组成的分子复合物。它通常用于生物医学研究和药物传递系统中，以制备具有特定性质的纳米颗粒或囊泡，用于药物传递、基因传递或其他相关应用。此复合物可通过化学方法进行修饰；

5、n＝40～50。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束及其制备方法和应用，所述的这种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束及其制备方法和应用要解决现有技术中的药物治疗结肠癌的效果不佳的技术问题。

2、本发明提供了一种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束，由第一胶束和第二胶束自组装而成，第一胶束的脂质内核为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，第一胶束的中间层为聚乙二醇，第一胶束的外层通过二硫键连接靶向β-catenin的多肽protac，第二胶束的脂质内核为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，第二胶束的中间层为聚乙二醇，第二胶束的外层通过二硫键连接靶向stat3的多肽protac，两种胶束单体均具有以下结构：其中x为靶向β-catenin的多肽protac lavtat，或靶向stat3的多肽protac savtat，n＝40～50，优选的n为45。

3、进一步的，所述的靶向β-catenin的protac lavtat的氨基酸序列为：ac-crrwprsildehvrrvwr-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2；所述的靶向stat3的protac savtat的氨基酸序列为：ac-cyyvswppdmmhy-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2。

4、本发明还提供了上述的一种双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)依据固相合成法，以rink amide mbha氨基树脂作为载体，o-(1h-6-氯苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/n,n-二异丙基乙胺为缩合体系，得到protaclavtat和protac savtat；所述的靶向β-catenin的protac lavtat的氨基酸序列为：ac-crrwprsildehvrrvwr-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2；所述的靶向stat3的protac savtat的氨基酸序列为：ac-cyyvswppdmmhy-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2；

6、(2)将protac lavtat与2,2'-二硫二吡啶溶于甲醇中，在搅拌的条件下，向溶液中缓慢滴加2,2'-二硫二吡啶溶液，避光，室温搅拌反应，透析去除过量的2,2'-二硫二吡啶溶液，冻干得到lavtat-硫吡啶纯品；

7、(3)将protac savtat与2,2'-二硫二吡啶分别溶于甲醇中，在搅拌的条件下，向溶液中缓慢滴加2,2'-二硫二吡啶溶液，避光，室温搅拌反应，透析去除过量的2,2'-二硫二吡啶溶液，冻干得到savtat-硫吡啶纯品；

8、(4)将lavtat-硫吡啶纯品、savtat-硫吡啶纯品分别和dspe-peg2000-sh溶于甲醇中，在搅拌的同时透析，随后冻干得到dspe-peg2000-lavtat纯品和dspe-peg2000-savtat纯品；

9、(5)分别称取dspe-peg2000-lavtat纯品和dspe-peg2000-savtat纯品，溶于氯仿和甲醇的混合有机溶剂中，旋蒸除去有机溶剂，在容器底部形成薄膜，再加入纯水水化得到双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束。

10、进一步的，protac lavtat、protac savtat和二硫二吡啶的摩尔比均为1：2-10。

11、进一步的，所述的lavtat-硫吡啶纯品、savtat-硫吡啶纯品和dspe-peg2000-sh的摩尔比均为1：2-10。

12、进一步的，所述的dspe-peg2000-lavtat和dspe-peg2000-savtat的摩尔比为1：1。

13、本发明还提供了上述的双靶点多肽蛋白降解靶向嵌合物自组装胶束在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

14、进一步的，所述的肿瘤为结直肠癌。

15、具体的，构建两种多肽protac分别用于降解β-catenin和stat3，所述的靶向β-catenin的protac lavtat氨基酸序列为：ac-crrwprsildehvrrvwr-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2；

16、靶向stat3的protac savtat氨基酸序列为：ac-cyyvswppdmmhy-ahx-alapyipygrkkrrqrrr-nh2。

17、本发明的多肽protac lavtat与savtat均由四部分功能各异的氨基酸序列组成：(1)靶蛋白靶向序列；(2)连接链；(3)e3泛素连接酶配体序列；(4)穿膜肽序列。

18、多肽protac lavtat中的β-catenin靶向序列(ac-crrwprsildehvrrvwr-nh2)能够与β-catenin特异性结合，源自文献报道[t.n.grossmann et al.inhibition ofoncogenic wnt signaling through direct targeting ofβ-catenin,proceedings ofthe national academy of sciences of the united states of america，2012，109，17942-17947]。

19、而多肽protac savtat中的stat3靶向序列(ac-cyyvswppdmmhy-nh2)能够与stat3特异性结合，取自文献报道[n.d.ambaye et al.novel anti-cancer candidates from acombinatorial peptide library,chem biol drug des，2021，97，87-96]。

20、多肽protac lavtat与savtat在连接链、e3泛素连接酶配体序列与穿膜肽序列方面具有相同的构成。它们的连接链皆为6-氨基己酸；e3泛素连接酶配体序列(ac-alapyip-nh2)是vhl的配体，功能为招募e3泛素连接酶vhl，启动泛素-蛋白酶体途径实现靶蛋白降解；穿膜肽序列tat(ac-ygrkkrrqrrr-nh2)的功能则为协助多肽protac穿透细胞膜。

21、本发明是通过两种多肽protac的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)化的聚合物自组装为胶束，将两种多肽protac分别与dspe-peg2000-sh通过二硫键连接，构建新型纳米药物双靶点多肽protac自组装胶束，以达到在肿瘤部位特异性降解β-catenin和stat3的目的。

22、本发明的优点在于：

23、1、本发明的双靶点多肽protac自组装胶束可同时降解β-catenin和stat3，对结直肠癌细胞hct116和ct26展现出较强的抑制活性。

24、2、本发明的双靶点多肽protac自组装胶束在肿瘤组织的蓄积相比游离药物显著提高。

25、3、本发明的双靶点多肽protac自组装胶束显著抑制balb/c小鼠皮下ct26结直肠癌的生长，发挥了比等剂量下单靶点多肽protac自组装胶束更强的抑制效果。

26、4、本发明的双靶点多肽protac自组装胶束显著抑制结直肠癌患者来源的类器官的生长。

27、5、本发明的双靶点多肽protac自组装胶束可有效激活抗肿瘤免疫，促进免疫细胞的浸润和活化。

28、6、本发明实现了肿瘤组织特异的β-catenin和stat3降解的同时重塑免疫抑制微环境，实现了两种多肽protac的高效协同抗肿瘤作用，具有较好的应用前景。