一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂及其应用

本发明属于生物饲料，具体涉及一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂及其应用。

背景技术：

1、甲烷（ch4）是导致全球气候变暖的第二大温室气体，对全球变暖贡献率达25%，其贡献仅次于二氧化碳（co2）。自1950年到2022年，甲烷在大气中的浓度从1100 ppb增加到1875 ppb(增加70%)。研究发现，ch4排放量的增加在很大程度上可归因于畜牧业。甲烷排放不仅造成环境问题，同样降低反刍动物对饲料能量的利用效率，每减少1 kg甲烷的排放，就可以多产17.7 kg标准乳或1.3 kg牛肉。反刍动物的瘤胃微生物发酵和粪便分解产生甲烷。其中ch4生成主要在瘤胃发酵过程（占87%），其余的ch4排放在大肠发酵过程中产生，瘤胃甲烷菌本身无法直接利用饲料中的碳水化合物生成ch4，而是利用其他瘤胃微生物产生的co2和h2，从而生成ch4，这点在瘤胃厌氧真菌和甲烷菌体外共培养研究中已经广泛证实。

2、枯草芽孢杆菌是一种可直接饲喂的益生菌，大量试验研究表明枯草芽孢杆菌可以提高奶牛的干物质采食量、饲料转化率和产奶量以及改善奶成分的作用。有研究表明，奶牛日粮中添加外源微生物可以有效的提高奶牛生产性能及饲料利用率，枯草芽孢杆菌可以通过调节瘤胃内微生物的组成，改变瘤胃发酵模式，使发酵模式倾向甲烷产生减少的模式。阿魏酸酯酶是水解阿魏酸和多糖之间酯键的酶，可以释放阿魏酸及其寡聚体，从而打开粗纤维的致密结构，暴露多糖酶切位点以促进其降解。因此，阿魏酸酯酶可以增加瘤胃对饲料消化吸收，提高饲料利用率，以减少甲烷的产生。目前，关于枯草芽孢杆菌协同阿魏酸酯酶减少瘤胃发酵产生甲烷的产量的研究报道还没有，其中减少甲烷的机制也还不十分明确。因此，研发枯草芽孢杆菌协同阿魏酸酯酶减少瘤胃甲烷产生将为农业生产中降低甲烷排放，节约资源，提高动物生产性能提供重要帮助。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂及其应用。所述的枯草芽孢杆菌和阿魏酸酯酶协同可以有效减少甲烷产量，进一步应用于动物生产中。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，所述阿魏酸酯酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的阿魏酸酯酶fae06084。

4、进一步的，所述阿魏酸酯酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、进一步的，，pcr扩增所述所述阿魏酸酯酶编码基因的引物为：

6、p.p-4-f：agaaaagagaggctgaagctatgaagacaatcttgtttacggcatttgc；

7、p.p-4-r：tctgagatgagtttttgttcaccctgaaaatacaggttttcgaattgact。

8、进一步的，pcr扩增体系为：primestar max dna聚合酶 25 μl，模板dna 0.5 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，ddh2o 20.5 μl。

9、进一步的，pcr扩增程序为：98℃变性10s，55-57℃退火5 s，72℃延伸10-40 s，30个循环，之后72℃延伸10 min。

10、进一步的，所述饲料添加剂中阿魏酸酯酶的质量比为0.2%~1.2%。

11、进一步的，所述饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为2.5×106 cfu/g ~ 20×106 cfu/g。

12、本发明还提供了所述的饲料添加剂在降低瘤胃发酵产生甲烷的产量中的应用。

13、进一步的，添加所述阿魏酸酯酶和枯草芽孢杆菌能够显著提高发酵的气体产量。

14、进一步的，所述饲料添加剂中添加质量比为0.3%的阿魏酸酯酶和含菌量为20×106 cfu/g枯草芽孢杆菌时，能够显著降低甲烷产量占气体总产量的百分比。

15、与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：本发明从新美鞭菌lgm-za7基因组中筛选出了一种阿魏酸酯酶，根据阿魏酸酯酶编码基因的gc含量以及毕赤酵母表达系统的密码子偏好性，对该基因进行密码子优化，将得到的优化的阿魏酸酯酶编码基因在毕赤酵母中表达，分离纯化得到阿魏酸酯酶蛋白，该酶具有良好的活性和稳定性。所述阿魏酸酯酶和枯草芽孢杆菌之间存在协同作用，可以有效的减少瘤胃液体外发酵产生的甲烷气体。

技术特征：

1.一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，所述阿魏酸酯酶为氨基酸序列如seq id no.1所示的阿魏酸酯酶fae06084。

2.根据权利要求1所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，所述阿魏酸酯酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

3.根据权利要求2所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，pcr扩增所述所述阿魏酸酯酶编码基因的引物为：

4.根据权利要求3所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，pcr扩增体系为：primestar max dna聚合酶 25 μl，模板dna 0.5 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，ddh2o 20.5 μl。

5.根据权利要求3所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，pcr扩增程序为：98℃变性10s，55-57℃退火5 s，72℃延伸10-40 s，30个循环，之后72℃延伸10 min。

6.根据权利要求1所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中阿魏酸酯酶的质量比为0.2%~1.2%。

7.根据权利要求1所述的阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的含菌量为2.5×106 cfu/g ~ 20×106 cfu/g。

8.权利要求1所述的饲料添加剂在降低瘤胃发酵产生甲烷的产量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，添加所述阿魏酸酯酶和枯草芽孢杆菌能够显著提高发酵的气体产量。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂中添加质量比为0.3%的阿魏酸酯酶和含菌量为20×106 cfu/g枯草芽孢杆菌时，能够显著降低甲烷产量占气体总产量的百分比。

技术总结本发明公开了一种阿魏酸酯酶协同枯草芽孢杆菌的饲料添加剂及其应用。该阿魏酸酯酶的原始编码基因是从新美鞭菌LGM‑ZA7的基因组中筛选得到。为了使该基因能够在异源表达载体中正常表达，对其进行密码子优化后重新合成基因，合成的基因最终被克隆、转化到毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行异源表达。表达出来的酶的实际分子量约为80 kDa，纯化后的酶表现出显著的阿魏酸酯酶酶活。表达出的阿魏酸酯酶与枯草芽孢杆菌之间存在协同作用，在底物中添加0.3%的阿魏酸酯酶和20×10<supgt;6</supgt; CFU/g枯草芽孢杆菌时，可以显著提高体外发酵的产气量和显著降低甲烷气体的百分比。该新型添加剂在反刍动物养殖中有很大的应用潜力。技术研发人员：成艳芬,吕东海,寇琳琳,朱伟云受保护的技术使用者：南京农业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/5