靶向性纳米级颗粒、靶向性细胞及其制备方法和用途

本发明涉及生物免疫治疗，具体地涉及靶向性纳米级颗粒、靶向性细胞及其制备方法和用途。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell,car t)在血液肿瘤的治疗中取得了瞩目的成就。目前已有针对cd19靶点的car t产品获批上市，另有多项针对其它靶点的car t产品正在进行临床试验。但是白血病在发展过程中，会出现靶点抗原的表达下降。有研究表明，有超过30％的b系白血病患者治疗后复发出现了cd19靶点表达下降。靶点抗原表达下调严重影响了car t细胞对白血病细胞的识别的杀伤，最终限制了car t的疗效。因此，促进car t对低靶点白血病细胞的识别和杀伤是提升car t疗效的关键。

2、背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明人通过研究发现铁蛋白受体cd71在各种病程的白血病细胞表面均能够稳定高表达，且car t细胞在体外扩增时cd71的表达呈现大幅上调。基于此，本发明开发了一种基于纳米级蛋白颗粒促进细胞间相互作用，进而促进例如car t对白血病细胞的识别和杀伤。此外，本发明的蛋白具有内部空腔，其为化疗药的装载提供了空间。因此，该剂型还能够装载药物实现car t与其它疗法的联合治疗，最终增强对多种病程白血病的疗效。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种靶向性纳米级颗粒，其中，所述靶向性纳米级颗粒由多个蛋白之间通过第一结合部相互连接组成，所述靶向性纳米级颗粒还包括第二结合部，且通过所述第二结合部与目标细胞的外表面结合。

3、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述靶向性纳米级颗粒能够结合靶向性细胞的外表面。

4、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述第一结合部包含活性基团，且第一结合部之间通过连接臂连接。

5、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述目标细胞的外表面包含所述蛋白的受体，并且所述受体能够通过所述第二结合部与所述蛋白结合。

6、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述靶向性细胞和目标细胞为天然表达cd71的细胞，其中，所述靶向性细胞包括t细胞、nk细胞、b细胞、淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、天然淋巴样细胞和/或白细胞中的至少一种。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述t细胞的类型不特别限定，优选地，所述t细胞包括修饰和未修饰的t细胞，其中所述修饰的t细胞包括car t细胞和tcr t细胞，所述未修饰的t细胞包括肿瘤浸润t细胞、pbmc来源的t细胞或其它从体内分离出的t细胞。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述靶向性纳米级颗粒为50nm以上且5000nm以下，优选为300-2000nm，还优选为300-1000nm。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述蛋白包含内部空腔。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述内部空腔包含或不包含药物。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒，其中，所述蛋白选自天然铁蛋白、重组全重链铁蛋白和基因工程改造铁蛋白中的至少一种。

12、本发明的第二方面，提供第一方面所述的靶向性纳米级颗粒的制备方法，其包括：

13、(1)使蛋白在电解质条件或非电解质条件下聚沉形成蛋白团簇；和

14、(2)使所述蛋白团簇在交联剂存在下进行交联，得到交联后的靶向性纳米级颗粒。

15、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒的制备方法，其中，所述交联剂的类型不特别限定，只要其能够使蛋白团簇发生交联即可，其实例包括但不限于：戊二醛、nhs-pegx-nhs、dss、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、多聚甲醛和聚乙烯亚胺。

16、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性纳米级颗粒的制备方法，其中，可选地在步骤(1)之前使免疫治疗药物和/或小分子化学药物进入所述蛋白的空腔的步骤。

17、本发明的第三方面，提供一种靶向性细胞，其中，在所述靶向性细胞的外表面结合有第一方面所述的靶向性纳米级颗粒，多个蛋白之间通过第一结合部相互连接从而组成所述靶向性纳米级颗粒，所述靶向性纳米级颗粒还包括第二结合部，且通过所述第二结合部与目标细胞的外表面结合。

18、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述第一结合部包含活性基团，且第一结合部之间通过连接臂连接。

19、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述目标细胞的外表面包含所述蛋白的受体，且所述受体能够通过所述第二结合部与所述蛋白结合。

20、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述靶向性细胞和目标细胞为天然表达cd71的细胞。

21、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述细胞选自αβt细胞、γδt细胞、自然杀伤(nk)细胞、天然淋巴样细胞(ilc)、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、t淋巴细胞和外周血单个核细胞中的至少一种。优选地，所述靶向性细胞选自car t细胞、tcr t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞中的至少一种；所述目标细胞包括来自血液肿瘤、实体瘤或其组合的细胞。

22、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述靶向性纳米级颗粒为50nm以上且5000nm以下。

23、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述蛋白包含内部空腔。

24、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述内部空腔包含或不包含药物。

25、在某些实施方案中，根据本发明所述的靶向性细胞，其中，所述蛋白选自天然铁蛋白、重组全重链铁蛋白和基因工程改造铁蛋白中的至少一种。

26、本发明的第四方面，提供一种靶向性细胞的制备方法，其包括：

27、(1)使铁蛋白在电解质条件或非电解质条件下聚沉形成蛋白团簇；

28、(2)使所述团簇在交联剂存在下进行交联，得到交联后的靶向性纳米级颗粒；

29、(3)使所述靶向性纳米级颗粒与细胞彼此靠近并接触，得到所述靶向性细胞。

30、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备方法，其中，可选地在步骤(1)之前使免疫治疗药物和/或小分子化学药物进入所述蛋白的空腔。

31、本发明的第五方面，提供一种促进细胞之间相互靠近的方法，其包括使用靶向性纳米级颗粒促进细胞彼此靠近和接触的步骤，其中多个蛋白之间通过第一结合部相互连接从而组成所述靶向性纳米级颗粒，所述靶向性纳米级颗粒还包括第二结合部，且通过所述第二结合部与细胞的外表面结合。

32、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述方法为体外方法，且所述细胞包括第一细胞和第二细胞。所述第一细胞和第二细胞可以是相同的细胞，也可以是不同的细胞。优选地，第一细胞和第二细胞不同。还优选地，所述第一细胞的表面通过例如cd71结合有靶向性纳米级颗粒，所述第二细胞表面具有cd71。

33、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述细胞选自car t细胞、tcrt细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中的至少一种，或癌症或肿瘤细胞，如白血病细胞，其中，所述癌症或肿瘤包括血液肿瘤、实体瘤或其组合。

34、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或其组合。

35、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、胰腺癌或其组合。

36、本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的靶向性纳米级颗粒或第三方面所述的靶向性细胞。

37、在某些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物，其中，还包括免疫治疗药物和/或小分子化学药物。

38、本发明的第六方面，提供根据第一方面所述的靶向性纳米级颗粒或第三方面所述的靶向性细胞，或根据第六方面所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途，其中，所述癌症或肿瘤包括cd71阳性肿瘤或癌症，优选b系白血病。

39、本发明的第七方面，提供根据第一方面所述的靶向性纳米级颗粒或第三方面所述的靶向性细胞，或根据第六方面所述的药物组合物与其它药物联合用药中的用途。其它药物包括但不限于诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

40、本发明的技术效果包括但不限于：

41、本发明示例性实施方案中利用聚沉-交联法制备出一种铁蛋白团簇纳米剂型。发现该剂型能够通过与car t表面的cd71结合修饰于car t表面，并由于团簇的较大粒径避免了本身内吞能力较弱的car t细胞对铁蛋白团簇的摄取，保证了铁蛋白团簇在car t表面的长期有效滞留。修饰后的car t细胞通过表面铁蛋白团簇与白血病细胞表面的cd71的结合增强了细胞间作用力，促进了car t对白血病抗原靶点的识别，进而促进了car t细胞的活化。此外白血病细胞较强的内吞能力使其能够将铁蛋白团簇从car t表面夺取下来并摄取，该过程促进铁蛋白空腔内的药物对白血病细胞的靶向杀伤，保证了car t与其它疗法对白血病的联合治疗。

42、在本发明中，进一步发现纳米蛋白颗粒具有内部空腔，其能够装载多种药物，例如三氧化二砷、阿霉素、四氧化三铁等，从而实现铁蛋白与其它多种疗法的联合治疗。此外还可以将铁蛋白进行基因工程等的改造，进一步扩大铁蛋白空腔体积或改变铁蛋白内部氨基酸残基以保证更多数量和种类的药物装载，实现更多疗法与car t的联合治疗。