整合素beta8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用

本发明属于细胞免疫治疗，涉及整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。

背景技术：

1、目前对于恶性肿瘤临床上主要的治疗手段包括手术、放疗、化疗等。但随着对机体免疫系统在肿瘤发生发展作用的深入研究和基因工程技术的进步，肿瘤治疗进行着革命性的进展，免疫治疗现已逐渐成为第四大肿瘤治疗方法，其主要通过增强针对肿瘤细胞的免疫应答，达到治疗肿瘤、防止肿瘤复发及转移的目的。相比于血液瘤，实体瘤的细胞疗法更需攻坚。

2、在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞会改变正常的发育过程，形成抑制性的肿瘤微环境(tμmor microenvironment，tme)，其中包括免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞以及多种抑制分子，如免疫抑制细胞因子，以及抑制性免疫检查点通路、抑制肿瘤浸润淋巴细胞杀伤肿瘤的能力。即使免疫细胞到达肿瘤部位，肿瘤微环境会抑制t细胞浸润和增殖，为免疫细胞浸润提供物理屏障。要发挥良好的t细胞治疗效果，需要将足够量的t细胞运输到肿瘤部位，而且t细胞必须浸润到肿瘤内部来发挥其杀伤肿瘤的作用，但肿瘤的微环境会阻止t细胞进入肿瘤内部。如何突破物理屏障也成为限制免疫细胞治疗实体瘤的重要制约因素。

3、过去十年里，car-t细胞疗法改变了肿瘤治疗领域的格局，尤其是在血液类肿瘤中展现出传统疗法无可比拟的治疗效果，为患者带来了新的希望。但这种前沿疗法对占据癌症大多数的实体瘤仍然效果不佳。新兴的免疫细胞治疗是将人体自身的免疫细胞进行收集，然后进行体外编辑、培养扩大，增强其靶向杀伤功能，然后回输体内，激活和增强机体免疫功能，到达抗肿瘤、抗病毒的目的。但是不论是免疫细胞治疗、还是传统的手术治疗、化疗、放疗等治疗实体瘤的效果均没有实质上的突破。因此，如何提高免疫治疗的效果，如提高免疫细胞浸润到肿瘤内部、并保持其在肿瘤微环境中杀伤肿瘤的活力，是临床应用的关键。

4、整合素是一种异二聚体膜糖蛋白，介导细胞与细胞和/或细胞与细胞外基质之间的相互作用，广泛分布于哺乳动物中。18个已知的α亚基和8个已知的β亚基构成24个整合素异源二聚体。虽然整合素在分布和功能上多种多样，但它们通常作为细胞膜上的粘附分子，在细胞迁移、增殖、分化和存活等各种生物过程中发挥重要作用，从而在止血、免疫反应、发育和癌症中发挥重要作用。在生理条件下，大多数整合素处于静息状态，与配体结合的亲和力较低。当被细胞间刺激激活时，整合素会发生整体构象变化，从低亲和状态转变为高亲和状态。这被称为由内到外的信号传递。高亲和力的整合素然后结合多聚配体，转导外-内信号，启动各种生物活性，如激酶激活、基因表达和细胞骨架重排。整合素beta8蛋白是一个独特的整合素亚家族。它不像其他整合素那样传输双向信号。然而，人们对其结构、配体、信号传导和功能知之甚少。整合素beta8蛋白在肿瘤以及免疫细胞中的作用也需要进一步的研究。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用，深入分析整合素beta8蛋白在肿瘤以及免疫细胞中的作用，发现整合素beta8蛋白可作为肿瘤治疗的新靶点。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用，所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。

4、本发明中，发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达(如敲除整合素beta 8的编码基因itgb8)，能够增强肿瘤细胞表面mhc分子的表达，提高肿瘤的免疫原性，提高其被抗原呈递细胞呈递的能力，促进其被抗原呈递细胞呈递给免疫细胞，此外，促进t细胞浸润，从而提高机体抗肿瘤免疫能力，此外，还发现在淋巴细胞(如t细胞)中使整合素beta8低表达或不表达(如敲除整合素beta 8的编码基因itgb8)，能够提高淋巴细胞浸润肿瘤细胞的能力，促进t细胞免疫从而展现出了更强的肿瘤杀伤效果；也就是说，本发明发现整合素beta8蛋白可作为肿瘤治疗的新靶点，针对肿瘤细胞和淋巴细胞均有效。

5、可以理解，本发明所述低表达指细胞内整合素beta 8的表达水平低于平均正常水平，不表达即细胞内整合素beta 8不表达，本领域技术人员能够理解并采用本领域的相应技术手段实现低表达或不表达，如采用rnai技术、crispr/cas9技术等等。

6、优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物。

7、优选地，所述核酸分子包括双链rna、sirna或sgrna中任意一种或至少两种的组合。

8、优选地，所述sgrna(用于crispr/cas9技术中引导cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括seq id no.1～seq id no.3所示的序列。

9、优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌或恶性淋巴瘤中任意一种。

10、seq id no.1(sgrna-1)：agacttctcccggtgtcacctgg；

11、seq id no.2(sgrna-2)：gtctcagtccaactgcatccagg；

12、seq id no.3(sgrna-3)：ctccagctgggtccggaatgcgg。

13、第二方面，本发明提供一种整合素beta 8的表达抑制剂，所述表达抑制剂包括sgrna(用于敲除整合素beta 8基因)，所述sgrna的核酸序列包括seq id no.1～seq idno.3所示的序列。

14、第三方面，本发明提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞低表达或不表达整合素beta 8。

15、优选地，所述工程化免疫细胞中含有载体，所述载体含有抑制整合素beta8蛋白表达的基因；或，所述工程化免疫细胞中缺失全部或部分整合素beta8基因。

16、优选地，免疫细胞中整合素beta8基因缺失或抑制其表达通过基因工程手段进行处理。

17、优选地，所述载体为慢病毒载体；一般慢病毒载体通过携带抑制序列(携带的抑制序列根据手段的不同而不同，对整合素beta8基因的抑制表达或敲除可选用不同的手段，如，rnai技术，crispr/cas9技术等等)，然后包装病毒，病毒感染免疫细胞，稳定转染，然后将免疫细胞中相应的基因抑制表达或敲除，然后进行筛选，即得到整合素beta8蛋白不表达或低表达的免疫细胞。

18、优选地，所述工程化免疫细胞的出发细胞包括t细胞、nk细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、nk细胞、单核/巨噬细胞或中性粒细胞中任意一种。

19、本发明构建的工程化免疫细胞低表达或不表达整合素beta 8，显著提高其浸润到肿瘤细胞的能力，可有效应用于提升宿主免疫活性。

20、第四方面，本发明提供第二方面所述的整合素beta 8的表达抑制剂，第三方面所述的工程化免疫细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。

21、第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面中所述的整合素beta 8的表达抑制剂或第三方面所述的工程化免疫细胞。

22、优选地，所述药物组合物还包括pd-1抗体。

23、本发明中，pd-1抗体指靶向pd-1(程序性死亡受体1)的抗体，为一种免疫药物(如市售的anti-pd-1单抗)，能够阻断pd-1与其配体的结合，本发明中发现，将整合素beta 8的表达抑制剂与pd-1抗体联用，能够显著提高治疗肿瘤效果。

24、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

25、优选地，所述辅料包括载体、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

26、第六方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备肿瘤增殖抑制剂中的应用，所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。

27、优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物；优选地，所述核酸分子包括双链rna、sirna或sgrna中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述sgrna(用于crispr/cas9技术中引导cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括seq idno.1～seq id no.3所示的序列。

28、第七方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备以非疾病诊断或治疗为目的肿瘤增殖抑制剂中的应用。

29、本发明中，发现整合素beta 8的表达抑制剂能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，可作为增殖抑制剂，具有广阔的应用前景，例如肿瘤细胞相关机制的基础研究中等。

30、优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物；优选地，所述核酸分子包括双链rna、sirna或sgrna中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述sgrna(用于crispr/cas9技术中引导cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括seq idno.1～seq id no.3所示的序列。

31、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

32、(1)本发明发现免疫细胞中缺失整合素beta 8会增强免疫细胞的功能，增加肿瘤内部浸润的t细胞的数量，增强抗肿瘤的免疫反应，为实体瘤的治疗提供新的手段以及理论基础。克服了其他治疗实体肿瘤方法中t细胞浸润较少的问题；

33、(2)本发明发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达，能够提高肿瘤的免疫原性，提高浸润到肿瘤内部免疫细胞的免疫应答能力和肿瘤杀伤能力，验证以腺病毒形式在肿瘤原位注射的方式，在肿瘤原位敲除整合素beta 8基因从而提高肿瘤的免疫原性、增强免疫细胞浸润；发现整合素beta 8的表达抑制剂和pd-1抗体联合应用能够相互协同，抗肿瘤效果显著提升。