一种具备协同放疗的免疫治疗纳米递送系统及其制备方法与应用

本发明属于医药，具体涉及一种具备协同放疗的免疫治疗纳米递送系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、近年来，放射治疗作为一种主流的癌症治疗方法，已广泛应用于临床实践。除了直接杀死癌细胞外，放射治疗过程中的电离辐射还会导致免疫原性细胞死亡(icd)和肿瘤抗原的释放，从而增强一定水平的抗肿瘤免疫反应。另外，以递送免疫调节剂或检查点阻断剂以及癌症疫苗为代表的免疫疗法也为癌症治疗提供了新方法。目前，众多文献也已经探索了放疗联合免疫治疗以抑制肿瘤生长与转移。

2、然而，放疗诱导的免疫反应往往会受到抑制，肿瘤微环境(tme)可能会大大降低t细胞的杀伤功能，一方面，该部位存在较高水平的免疫抑制细胞，如调节性t细胞(tregs)、髓源性抑制细胞(mdscs)和m2型巨噬细胞，能够抑制放疗诱导的抗肿瘤免疫应答；另一方面，肿瘤部位的缺氧状态可以激活低氧诱导因子(hif)信号通路，导致vegf水平升高，进一步刺激肿瘤生长，提高肿瘤的侵袭性。因此迫切需要开发能够逆转免疫抑制tme的策略，同时引发强大的抗肿瘤免疫，以实现更好的治疗效果。

3、此外，目前针对免疫治疗的免疫调节剂等药物由于存在水溶性较差，其生物利用度较低的问题，导致在到达肿瘤部位之前就会迅速分布并很快从体内清除，从而在实际应用中存在较大限制，因此，目前迫切需要开发更好的给药系统，以提供更局部、更持久的免疫反应，从而提高免疫药物的安全性和有效性。

技术实现思路

1、本发明在目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种具备协同放疗的免疫治疗纳米递送系统及其制备方法与应用，实现了良好的靶向给药性能以提供更局部、更持久的免疫反应，并且克服了乏氧环境并调节该部位微环境功能的同时，实现了sting通路的激活，具有放疗增敏作用，对于增强抗肿瘤免疫应答具有重要的研究价值和现实意义。

2、为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

3、第一方面，本发明提供了一种具备协同放疗的免疫治疗纳米递送系统，所述纳米递送系统包括二氧化锰纳米片，以及包覆在二氧化锰纳米片外的癌细胞膜；所述二氧化锰纳米片中负载免疫药物。

4、纳米片是二维纳米材料的一种，具有悬浮片状结构和较大的比表面积，可以通过静电、氢键和非共价相互作用(如范德华力)与药物结合。二氧化锰是一类具有氧化还原活性的过渡金属材料，其可以消耗肿瘤部位过量存在的h2o2产生氧气以缓解肿瘤部位的缺氧状态，进一步增强放疗诱导的免疫反应；另外，已有研究表明，电离辐射可以激活干扰素基因刺激因子(sting)通路，刺激i型干扰素的产生和促炎细胞因子的分泌，从而促进树突状细胞成熟，触发先天和适应性免疫以对抗癌症，而mn2+可以通过增加cgas酶的整体催化活性以及提高cgamp与sting的亲和力来激活cgas-sting通路，从而进一步增强抗肿瘤免疫应答。因此，开发基于二氧化锰的免疫药物纳米递送系统，用于协同肿瘤放射治疗将是一个非常有意义的研究方向。

5、癌细胞膜涂层可模仿天然细胞膜，减少网状内皮细胞对其的清除；另外，也有研究表明，因癌细胞膜具备负电荷、磷脂双分子层和特异性的蛋白表达，包被癌细胞膜的纳米粒对同源癌细胞具有很强的靶向性，并能在一定程度上激活免疫反应，并且赋予纳米递送系统良好的稳定性和生物相容性。

6、经试验探究发现，本发明所述纳米递送系统能与放疗相结合，有效克服癌细胞的辐射抗性，同时诱发活性氧产生从而破坏肿瘤细胞dna，进一步提高免疫原性细胞死亡水平，释放atp、hmgb1以及crt等损伤相关分子模式，增加抗原递呈细胞-树突细胞对肿瘤抗原的摄取，引起免疫反应；并且，所述纳米递送系统可以消耗肿瘤部位过量存在的h2o2产生氧气以克服肿瘤部位的缺氧微环境并改善肿瘤部位的免疫耐受，进一步增强放疗诱导的免疫反应；此外，所述纳米药物递送系统可实现更局部、更持久的释放免疫药物和mn2+，从而通过分别促进tnf-α等炎症因子的释放和cgas-sting信号通路的激活诱发更强烈的抗肿瘤免疫，为提高抗肿瘤效果提供新的可能性，对于构筑肿瘤协同治疗的纳米药物递送系统有一定的借鉴意义。

7、优选地，所述免疫药物包括免疫调节剂、检查点阻断剂和肿瘤疫苗，优选地，所述免疫药物为r848。

8、resiquimod(r848)是一种基于咪唑喹啉酮的小分子免疫佐剂，能与tlr7/8结合触发免疫反应，r848可通过将mdscs转化为抗原递呈细胞(apcs)并将巨噬细胞表型从m2极化为m1，进而调控免疫抑制微环境，最终诱导抗癌反应。本发明通过将所述纳米递送系统负载r848用于肿瘤免疫治疗，有效解决了r848水溶性较差的问题，使其生物利用度明显提高，实现了更稳定、更持久的免疫反应。

9、优选地，所述癌细胞膜包括乳腺癌细胞膜。

10、本发明试验中利用乳腺癌细胞(4t1)膜包覆负载免疫药物的二氧化锰纳米片制备纳米递送系统，实现了对同源乳腺癌细胞很强的靶向性，并能在一定程度上激活免疫反应，为提高乳腺癌的治疗效果提供新的可能。

11、优选地，所述负载免疫药物的二氧化锰纳米片的制备方法包括以下步骤：

12、(1)将二氧化锰纳米片水溶液与mpeg-nh2混合，超声，搅拌，离心，除去上清后得到沉淀，清洗沉淀，得到纳米复合材料；

13、(2)将步骤(1)的纳米复合材料与免疫药物混合，超声，搅拌，离心，除去上清后得到沉淀，用醇类溶剂清洗沉淀，得到载药二氧化锰纳米片。

14、优选地，所述步骤(1)中，二氧化锰纳米片水溶液和mpeg-nh2的质量比为2：(0.5-1.5)。

15、mpeg-nh2作为表面修饰剂，可以提高纳米片的水溶性并增强其在生物体内的稳定性，同时mpeg-nh2的加入可以影响载药二氧化锰纳米片的药物释放速率，并且mpeg-nh2作为一种生物相容性较高的聚合物，可以提高载药纳米片的生物相容性，适当的用量比可以确保纳米片在体内的生物相容性和生物安全性；经试验探究发现，当二氧化锰纳米片水溶液和mpeg-nh2的质量比为2：(0.5-1.5)时，制得的纳米递送系统能实现良好的载药效率和稳定性，且具备适宜的药物缓释效果，从而实现更稳定、更持久的药物免疫反应。

16、优选地，所述步骤(2)中，纳米复合材料和免疫药物的质量比为1：(1-2)。

17、经试验探究发现，纳米复合材料与免疫调节剂药物的用量比对最终制得的纳米递送系统的释放速率以及药物的生物活性等方面产生重要影响，当纳米复合材料和免疫调节剂的质量比为1：(1-2)时，所述纳米递送系统能确保药物在纳米载体上的稳定、均匀分布，避免药物的聚集或过度释放，从而提高免疫药物的稳定性和持久性，并且能够在目标组织或细胞中实现有效的释放，从而提高药物的生物活性。

18、第二方面，本发明提供了上述纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：

19、(1)将二氧化锰纳米片水溶液与mpeg-nh2混合，超声，搅拌，离心，除去上清后得到沉淀，清洗沉淀，得到纳米复合材料；

20、(2)将步骤(1)的纳米复合材料与免疫药物混合，超声，搅拌，离心，除去上清后得到沉淀，用醇类溶剂清洗沉淀，得到载药二氧化锰纳米片；

21、(3)收集消化后的癌细胞，离心，弃上清，用pbs重悬细胞沉淀，离心，弃上清，得到细胞沉淀；

22、(4)将生理盐水、水和pmsf混合，配置低渗缓冲液，所述生理盐水、水和pmsf的质量比为75:25:1；

23、(5)将步骤(3)的细胞沉淀用步骤(4)的低渗缓冲液重悬1-1.5h，然后用超声破碎仪超声处理，1000-2000rpm条件下离心5-10min，收集上清液；

24、(6)将步骤(5)的上清液在15000-17000rpm条件下离心1-1.5h，弃上清收集细胞膜碎片，再用pbs清洗，冷冻干燥，得到癌细胞膜；

25、(7)将癌细胞膜与步骤(2)的载药二氧化锰纳米片在水中悬浮混合，冰浴超声，得到混合液；

26、(8)将步骤(7)的混合液通过聚碳酸酯膜挤出，得到癌细胞膜包覆的载药纳米片，即所述的纳米递送系统。

27、优选地，所述步骤(7)中，癌细胞膜和载药二氧化锰纳米片的质量比为1：(0.5-1.5)。

28、经试验探究发现，当癌细胞膜和载药二氧化锰纳米片的质量比为1：(0.5-1.5)时，可以确保癌细胞膜充分覆盖载药纳米材料表面，提高药物递送系统的稳定性，并且在一定程度上避免免疫药物的损失或泄露，提高药物的生物利用度。

29、第三方面，本发明还提供了上述的纳米递送系统在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

30、优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

32、(1)本发明基于肿瘤缺氧环境，开发了可以生成氧气的二氧化锰载药纳米递送系统(即本技术的免疫治疗纳米递送系统)，在克服乏氧条件的同时实现了sting通路的激活，具有放疗增敏作用。

33、(2)本发明构建了癌细胞膜包被负载r848的二氧化锰纳米递送(即本技术的免疫治疗纳米递送系统)，具有协同放疗和免疫治疗的双重功能，可以进一步增加抗肿瘤效果，对于构筑肿瘤协同治疗的纳米药物递送系统有一定的借鉴意义。