一种永生化人源皮脂腺前体细胞、其制备方法以及采用该皮脂腺前体细胞进行油脂调节类药物或护肤品筛选、评价的方法

本发明属于皮肤油脂类调节模型，具体涉及一种永生化人源皮脂腺前体细胞、其制备方法以及采用该皮脂腺前体细胞进行油脂调节类药物或护肤品筛选、评价的方法。

背景技术：

1、近年来，寻常痤疮、干皮病、脂溢性皮炎等损容性皮肤病的发病率明显增加，其发病的机理与皮脂腺的功能异常密切相关。皮脂腺存在于真皮层，是皮肤的重要附属器官之一，在皮脂腺中存在皮脂腺细胞，新生的皮脂腺细胞不断向中心移动，体积增加，胞质内的脂滴越来越多，细胞核固缩、细胞器消失，胞质内充满脂滴。最后腺细胞解体并与脂滴同时排出，即为皮脂。所分泌的皮脂可以滋润皮肤、毛发，和汗液一起形成脂质膜保护皮肤，在维持皮肤稳态中发挥了重要作用，同时，皮脂腺功能的异常会造成多种皮肤问题。

2、痤疮是一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，好发于面部及前胸、后背，临床上主要表现为粉刺、丘疹、脓疱、囊肿或结节，常伴有毛孔粗大和皮脂溢出。青少年发病率高达93％，已成为全球第八大慢性疾病，中国人群截面统计痤疮发病率为8.1％。但研究发现超过95％的人会有不同程度痤疮发生，不早期干预和治疗易留下瘢痕，严重影响患者的生活质量。因此，为了揭示痤疮病理生理机制和研发抑制皮脂异常分泌的医药品或化妆品，构建能够再现痤疮患者皮脂腺行为的细胞模型至关重要。

3、目前，作为可以利用于实验的皮脂腺细胞株，已知有仓鼠皮脂腺细胞株，该细胞与生物体的皮脂腺细胞同样地具有在细胞内形成脂滴的优点，但其基因组信息未弄清，因此，不适于利用遗传学方法的研究。非专利文献1中公开通过sv40的巨大t抗原dna的转染而永生化的源自人的皮脂腺细胞株sz95也常应用于皮脂腺相关实验研究。该细胞源自人，基因组信息完整清楚，增殖性高，但sz95缺乏雄激素受体，它们不能响应睾酮促进脂肪生成，在体外进行培养则失去形成脂滴的能力，不能完全代表自然生长状态下的皮脂腺细胞，更无法复刻痤疮患者的皮脂腺行为。此外，由于hpv、eb病毒中癌基因的引入，目标细胞可能有潜在恶变风险(zouboulis cc,seltmann h,neitzel h,et al.establishment andcharacterization of an immortalized human sebaceous gland cell line(sz95)[j].j invest dermatol,1999,113(6):1011-1020.)。非专利文献2通过不同植物油干预诱导sz95促使其脂化，虽能刺激皮脂生成，但对细胞因子分泌也有影响。因此，永生化皮脂腺细胞培养被视为痤疮发病机制关键特征不恰当的模型(zouboulis cc,hossini am,hou x,wang c,weylandt kh,pietzner a.effects of moringa oleifera seed oil oncultured human sebocytes in vitro and comparison with other oil types.int jmol sci.2023jun 19；24(12):10332.)。非专利文献3中通过使用显微外科手术器械，从人的皮肤中分离出皮脂腺细胞进行原代培养时，虽然在细胞质中可以看到脂质的蓄积，但只能生长3-6代，且所获取的细胞数量有限，不能非常有效地扩增，很难进行持续、大量和深入的研究，若从多人来源获取，细胞的性状不均一，很难避免由此导致的研究结果不稳定，削弱了不同研究之间结果的可比性(xia lq,zouboulis c,detmar m,et al.isolation ofhuman sebaceous glands and cultivation of sebaceous gland-derived cells as anin vitro model[j].j invest dermatol,1989,93(3):315-321.)。

4、因此，本领域迫切需要一种不使用动物细胞并具有更高纯度和产量的人皮脂前体细胞的方法，该方法可适用于为疾病建模和开发创新治疗方法提供相关的体外模型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建出人源化稳定的体外皮脂腺细胞，用来解决背景技术中的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种永生化人源皮脂腺前体细胞、其制备方法以及采用该皮脂腺前体细胞进行油脂调节类药物或护肤品筛选、评价的方法。

3、本发明提供的一种永生化人源皮脂腺前体细胞，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2023286，分类命名：人源诱导多能干细胞衍生的皮脂腺前体细胞ips-sbp1#,地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2023年10月10日。

4、制备上述细胞的方法，包括如下步骤：

5、(1)肾上皮细胞的分离与扩增培养：

6、①肾上皮细胞的分离：

7、a.收集痤疮患者尿液分装至50ml离心管中，400xg，室温离心10分钟，弃上清，保留1-2ml液体；

8、b.取10ml urineasy尿液细胞分离培养试剂盒中的洗涤液，重悬沉淀并转移至另一离心管，200xg，室温离心10分钟，弃上清，然后用urineasy尿液细胞分离培养试剂盒中的培养基重悬细胞沉淀，并接种至提前使用matrigel包被的培养板中；

9、c.培养24h后，观察细胞有无污染，若无污染，加入800μl的urineasy尿液细胞分离培养试剂盒中的培养基，重复该步骤培养3天；

10、d.第4天，观察有无污染和贴壁细胞，若无污染，弃掉孔中2/3培养基，再加入800μl的urineasy尿液细胞分离培养试剂盒中的培养基，此后每日观察有无污染和贴壁细胞，再使用所述培养基隔日半量或全量换液；

11、②肾上皮细胞的扩增和培养:

12、a.经过上述步骤①的分离，当肾上皮细胞汇合度为80-90％时，可进行传代与扩增；

13、b.弃孔中培养基，使用pbs清洗一遍，在质量浓度为0.25％胰蛋白酶消化液培养箱中37℃消化3分钟，加入所述消化液2倍体积的urineasy尿液细胞扩增培养试剂盒中的扩增培养基础培养基终止消化，轻柔吹打培养孔底面，使细胞脱落；

14、c.收集细胞悬液至15ml离心管，1200rpm，室温离心3分钟，弃上清，使用所述urineasy扩增培养基础培养基重悬细胞沉淀，轻柔吹打为单细胞悬液，将细胞均匀接种至matrigel包被培养板中；

15、(2)人诱导多能干细胞系的建立和扩增培养：

16、①人诱导多能干细胞系的建立：

17、a.步骤(1)尿液来源肾上皮细胞传代时，分别按照5000/孔、10000/孔、15000/孔细胞密度种板于matrigel包被处理的96孔板中，每一梯度设置3个复孔，此时记录为第-1天；

18、b.次日，镜下观察细胞状态，各密度梯度选择一孔进行细胞计数，选择细胞数量在10000-20000个之间的1个培养孔进行后续实验；

19、c.10μl货号为ca5002002-1的重编程添加剂ⅰ与10ml urineasy尿液细胞扩增培养试剂中的培养基混匀，配制为“重编程培养基a”，取100μl重编程培养基a，与10μl货号为ca5002002-2的重编程添加剂ⅱ混匀，配制为“重编程培养基b”，弃选定孔中培养基，加入重编程培养基b，此时记录为第0天；

20、d.每天镜下观察细胞形态变化，连续培养2天；

21、e.第3天，镜下观察细胞形态，若细胞形态变化明显，且细胞达到100％汇合度时，可进行传代；

22、f.细胞传代时，首先配制重编程培养基c，向10ml urineasy尿液细胞扩增培养试剂盒中的培养基中加入10μl货号为ca5002002-3的重编程添加剂ⅲ，混匀，弃待消化细胞培养孔中培养基，加入pbs清洗一遍后，向培养孔中加入50μl胰酶，培养箱中37℃消化3分钟，加入100μl重编程培养基c终止消化，吹打培养孔底面，收集细胞悬液至装有重编程培养基c的离心管中，吹打混匀，按照1：6-1：10传代比例，将细胞均匀接种至matrigel包被培养板中；

23、g.第4天，换液urineasy尿液细胞扩增培养试剂盒中的培养基；

24、h.每日观察细胞状态，若镜下观察发现小簇克隆，使用货号为ca5003050-1的reproeasy人体细胞重编程基础培养基每日换液；

25、i.若发现有多个由10个以上细胞组成的克隆，将培养基更换为货号为ca1007500的pgm1人多潜能干细胞培养基；

26、j.镜下观察细胞，培养至多个克隆大小可填满10倍镜视野，使用1ml注射器针头切割克隆，200μl无菌移液枪头将克隆与培养孔底壁分离，吸出克隆并转移至装有所述pgm1人多潜能干细胞培养基的matrigel包被的24孔板中，放回培养箱中培养，培养条件为37℃，体积浓度为5％二氧化碳，90％以上的湿度；

27、k.每日观察，使用所述pgm1人多潜能干细胞培养基换液；

28、②人诱导多能干细胞系的扩增培养：

29、a.镜下观察细胞状态良好，细胞汇合度约80％时，或克隆分布不均出现单个克隆面积较大时，可进行传代；

30、b.弃孔中培养基，加入pbs清洗一遍，加入货号为ca1023100的dissoeasy人多潜能干细胞消化液，室温消化3-5分钟，弃掉孔中消化液，加入所述pgm1人多潜能干细胞培养基，轻柔扇形吹打培养孔底面，使细胞脱落，收集细胞悬液至离心管中。按照体积比1：5-1：10将细胞悬液接种至matrigel包被的培养板中，培养箱中继续培养，培养条件为37℃，体积浓度为5％二氧化碳，90％以上的湿度，此后每日观察，每日使用pgm1人多潜能干细胞培养基换液；

31、(3)皮脂腺前体细胞的分化

32、a.将步骤(2)得到的人诱导多能干细胞换液，配置人诱导多能干细胞分化为皮脂腺前体细胞的基础分化培养基，基础分化培养基由下述成分组成：

33、

34、b.每天更换所述步骤(a)中所述的基础分化培养基，37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养三天；

35、c.细胞培养三天后，更换培养基为皮脂腺前体分化激活培养基，激活培养基是在步骤(a)中的基础分化培养基中添加20ng/ml表皮生长因子，1ng/ml骨形态发生蛋白4；

36、d.隔天更换皮脂腺分化激活培养基，37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养7-8天；

37、e.配制皮脂腺前体分化培养基，培养基由如下成分组成：

38、epilifetm培养基：dermacult角质形成细胞扩增培养基体积比1：1

39、表皮生长因子 20ng/ml

40、骨形态发生蛋白4 1ng/ml

41、f.采用所述分化培养基37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养第10-11天，用tryple对细胞进行消化，消化方法为在二氧化碳培养箱中37℃消化15分钟，200xg离心3分钟，弃上清，在皮脂腺前体分化培养基中添加10μm二盐盐酸atp竞争性rock抑制剂进行重悬细胞；

42、g.将步骤(f)得到的细胞种于25μg/ml纤维粘连蛋白包被的培养板中；

43、h.37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养第12-13天，更换培养基为新鲜的皮脂腺前体分化培养基；

44、i.细胞每天换液，再连续37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养7-9天，获得皮脂腺前体细胞。

45、本发明还提供了，采用所述前体细胞进行油脂调节类药物或护肤品筛选、评价的方法，直接将皮脂腺前体细胞与dht双氢睾酮在室温条件下，共通孵育48h，刺激出皮脂腺前体细胞更多的油脂细胞，以此模型来进行油脂调节类药物或护肤品的筛选、评价，或将皮脂腺前体细胞培养分化成成熟皮脂腺细胞，采用成熟皮脂腺细胞再进行药物或护肤品筛选、评价的方法。

46、进一步的，将皮脂腺前体细胞培养分化得到成熟皮脂腺细胞，利用该细胞进行油脂分泌类药物或护肤品的筛选和评价，皮脂腺前体细胞培养分化得到成熟皮脂腺细胞的方法为：

47、a.配制成熟皮脂腺基础分化培养基，培养基由如下成分组成：

48、

49、

50、b.用tryple对皮脂腺前体细胞进行消化：37℃、体积浓度为5％co2培养箱消化15分钟，250xg离心3分钟，弃上清，在成熟皮脂腺基础分化培养基中添加10μm二盐盐酸atp竞争性rock抑制剂，然后进行重悬细胞，以2.5×104cells/cm2细胞密度种于培养板中，37℃、体积浓度为5％co2培养箱培养过夜；

51、c.第二天进行换液，并添加10μm tgf-β/smad抑制剂于成熟皮脂腺基础分化培养基中；

52、d.每天换液，37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养3天；

53、e.3天后，换液成熟皮脂腺最终分化培养基，37℃、体积浓度为5％co2培养箱培养；

54、f.每天换液，37℃、体积浓度为5％co2培养箱连续培养3-6天，获得成熟皮脂腺细胞.

55、进一步的，所述步骤(e)中成熟皮脂腺最终分化培养基是在成熟皮脂腺基础分化培养基中添加10μm tgf-β/smad抑制剂得到；或在成熟皮脂腺基础分化培养基中添加10μmtgf-β/smad抑制剂和1μm ppar-β/δ激动剂得到；或者在成熟皮脂腺基础分化培养基中添加10μm tgf-β/smad抑制剂、1μm gw0742 ppar-β/δ激动剂和5μm环巴胺得到。

56、综上，本发明有益效果：(1)本发明所采用的制备所述永生化人源皮脂腺前体的方法，采用痤疮患者尿液中的人诱导多能干细胞进行培养分化，痤疮患者本身油脂分泌旺盛，故为后续能够得到具有良好的在体外能够分泌油脂提供了基础保障；(2)本发明采用的制备所述永生化人源皮脂腺前体细胞的方法，在利用人诱导多能干细胞向皮脂腺前体细胞分化时，获得的皮脂腺前体细胞具有高水平表达皮脂腺前体细胞标志物，分化能力稳定、准确；(3)本发明得到的永生化人源皮脂腺前体细胞，皮脂腺前体细胞脂滴形成、脂质蓄积和雄激素受体相关基因明显表达增加，且稳定性强，能够很好的用于油脂分泌类调节药物或护肤品的筛选和评价；(4)采用本发明前体细胞对油脂调节类药物或护肤品进行筛选、评价时，还可以采用所述前体细胞进一步培养分化成成熟皮脂腺细胞，得到的成熟皮脂腺细胞可以高表达标志物，并具有人体内皮脂腺细胞形成或蓄积脂滴的性质，在雄性激素的刺激下加速细胞的成熟、分化，释放更多的脂滴，具有明确的遗传信息和临床背景，具有稳定性，能够在体外模拟痤疮患者皮脂腺行为，准确、方便的用于油脂调节类药物或护肤品的筛选和评价。