一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法和应用

本发明涉及纳米颗粒疫苗制备，尤其是涉及一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、口服蛋白质疫苗是一种安全性高、依从性强的免疫手段，fda批准的口服蛋白质疫苗主要用于肠道病原菌(如霍乱弧菌)感染的治疗。口服蛋白质疫苗是生物药与新型疫苗领域的前沿热点。口服蛋白质疫苗允许蛋白质抗原在通过胃肠运输时直接暴露于肠道相关淋巴组织，从而激活黏膜免疫应答。甚至更有效地激活机体的系统免疫，以建立更广泛和持久的免疫保护。蛋白质疫苗的口服递送需要克服恶劣的胃肠道环境，避免诱导免疫耐受以实现有效保护。

2、随着纳米技术的发展，科学家们开发出了纳米颗粒疫苗，助力口服蛋白质疫苗递送，不仅可以保护蛋白质抗原过早降解，而且将抗原靶向递送到抗原提呈细胞。纳米颗粒作为免疫佐剂、递送载体和抗原展示平台，在提高免疫原性、增强疫苗免疫效应中扮演着重要角色。目前，纳米颗粒疫苗的研究大都处于临床试验阶段或临床前研究，如呼吸道合胞病毒疫苗、流感疫苗和covid-19疫苗等。

3、随着合成生物学技术的发展，人们通过dna操作技术来改造细菌用于构建生产激素、干扰素以及抗体的“生物工厂”。此外，由于细菌的群体感应和对环境的反应等能力，一些细菌被改造为“智能工程菌”，用于不同类型疾病的诊疗，如炎性肠病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等。工程菌是设计和建造的微型机器人，在人体内作为“活体生物药”来发挥特定功能。关于工程菌“活体生物药”，在《nature》、《science》、《cell》等生物医学顶级期刊已发表一系列颠覆性研究成果。目前，基于工程菌的临床转化应用也在如火如荼开展。2021年，synlogic公司用于治疗苯丙酮尿症(pku)的工程大肠杆菌(synb1618)有望进入3期临床试验。利用工程菌表达重组抗原在口服蛋白质疫苗领域具有很大的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法，以提供一种群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌，用来生产纳米颗粒疫苗，以提高纳米颗粒疫苗的生产效率，有效改善疫苗的免疫效应，并实现周期释放的效果。

2、为实现上述目的，本发明提供一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法和应用，一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，步骤如下：

3、s1、构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒的工程菌；

4、s2、构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌；

5、s3、构建群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌。

6、优选的，所述步骤s1构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒工程菌的具体步骤如下：

7、s1.1、以prsfduettm-1载体为骨架，bmc-h为目的基因分别进行pcr扩增；

8、s1.2、将扩增得到的载体片段和目的基因片段通过同源重组法构建prsfduettm-1-bmch质粒载体；

9、s1.3、将扩增得到的质粒导入大肠杆菌中即可得到稳定表达细菌微组分蛋白颗粒工程菌。

10、优选的，所述步骤s1.1中扩增载体的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物如seq id no.2所示，扩增目的基因的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物如seqid no.4所示。

11、优选的，所述步骤s1.1中pcr扩增体系为：prime star max premix(2×)10μl；ddh2o 5μl；上游引物2μl；下游引物2μl；以目的基因bmc-h和prsfduettm-1载体为模板，分别添加1μl；扩增程序为98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃15s，共30个循环；72℃5min；12℃10min。

12、优选的，所述步骤s2构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗工程菌的具体步骤如下：

13、s2.1、以步骤s1得到的prsfduettm-1-bmch载体为骨架，免疫表位gp70衍生肽ah1-a5为目的基因分别进行pcr扩增；

14、s2.2、将扩增得到的载体片段和目的基因片段通过同源重组法构建prsfduettm-1-bmch-ah1-a5质粒载体，将扩增得到的质粒导入大肠杆菌中即可得到稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗工程菌。

15、优选的，所述步骤s2.1中扩增载体的上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq id no.6所示。扩增目的基因的上游引物序列如seq id no.7所示，下游引物序列如seq id no.8所示；扩增体系与构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒工程菌相同；扩增程序为98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃5s，共30个循环；72℃5min；12℃10min。

16、优选的，步骤s3中构建群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗工程菌的具体步骤如下：将群感调控同步裂解质粒为ptd103luxi_sfgfp质粒直接导入到步骤2得到的稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗工程菌即可。

17、优选的，所述步骤s1、s2、s3中所用的大肠杆菌为相同菌株。

18、一种如上所述方法构建的工程菌。

19、一种如上所述方法构建的工程菌在蛋白疫苗生产中的应用。

20、因此，本发明提供的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法和应用，其具体技术效果如下：

21、(1)本发明首次公开一种群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌，使抗原规律地分布在纳米颗粒表面，显著提高局部抗原的有效密度，进而有效改善抗原的免疫效应；

22、(2)本发明以具有二十面体对称结构的bmch为骨架，制备的群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌，可以合成具有二十面体对称结构的纳米疫苗，在群感信号的调控下，有望实现纳米疫苗—bmch-ah1-a5的周期性释放；

23、(3)本发明提供的工程菌构建方法，过程简单、易操作、制备成功率高。

24、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

技术特征：

1.一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤s1构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒工程菌的具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s1.1中扩增载体的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物如seq idno.2所示，扩增目的基因的上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物如seq id no.4所示。

4.根据权利要求2所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s1.1中prsfduettm-1的pcr扩增体系为：prime star max premix(2×)10μl；ddh2o 5μl；上游引物2μl；下游引物2μl；以目的基因bmc-h和prsfduettm-1载体为模板，分别添加1μl；扩增程序为98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃15s，共30个循环；72℃5min；12℃10min。

5.根据权利要求1所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤s2构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗工程菌的具体步骤如下：

6.根据权利要求5所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s2.1中扩增载体的上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq idno.6所示。扩增目的基因的上游引物序列如seq id no.7所示，下游引物序列如seq idno.8所示；扩增体系与构建稳定表达细菌微组分蛋白颗粒工程菌相同；扩增程序为98℃10s；98℃10s，55℃5s，72℃5s，共30个循环；72℃5min；12℃10min。

7.根据权利要求1所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于，步骤s3中构建群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗工程菌的具体步骤如下：将群感调控同步裂解质粒为ptd103luxi_sfgfp质粒直接导入到步骤2得到的稳定表达细菌微组分蛋白颗粒纳米疫苗工程菌即可。

8.根据权利要求1所述的一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤s1、s2、s3中所用的大肠杆菌为相同菌株。

9.一种如权利要求1～8任一项所述方法构建的工程菌。

10.一种如权利要求1～8任一项所述方法构建的工程菌在蛋白疫苗生产中的应用。

技术总结本发明公开了一种生产蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌及其构建方法和应用，属于纳米颗粒疫苗制备技术领域。本发明首次公开一种群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌，使抗原规律地分布在蛋白纳米颗粒表面，显著提高局部抗原的有效密度，进而有效改善抗原的免疫效应；以具有二十面体对称结构的细菌微组分BMCH为骨架，制备的群感调控同步裂解释放蛋白颗粒纳米疫苗的工程菌，可以合成具有二十面体对称结构的纳米疫苗，在群感信号的调控下，有望实现纳米疫苗—(BMCH‑AH1‑A5)的周期性释放；工程菌构建方法，过程简单、易操作、制备成功率高。技术研发人员：叶硕,张英英,徐凌云,倪可欣,尹杭,陆昱利,陈诗情,汤敏煊,李亦泽受保护的技术使用者：徐州医科大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18