一种突触囊泡的提取方法

本发明专利涉及生物提取，尤其是指一种哺乳动物突触囊泡的提取方法。

背景技术：

1、突触囊泡(synaptic vesicles，svs)是神经元突触末梢的小囊泡，用来储存神经递质，是神经递质释放的重要细胞器。通过膜融合和分泌作用，突触囊泡将储存的神经递质释放到突触间隙中，与突触后末梢的受体结合，从而触发神经信号的传递。突触囊泡储存和保护多种神经递质，如乙酰胆碱、谷氨酸和gaba等，并在需要时释放到突触间隙中。通过调控突触囊泡的释放速率和数量，神经元可以调节神经信号的强度和频率。此外，突触囊泡的释放还参与突触可塑性的调节，这是神经系统中神经元连接强度和功能可调节的能力，包括长时程增强和长时程抑制等。

2、突触囊泡在神经系统中扮演着重要的角色，它是神经元末梢的囊状结构，专门负责储存和释放神经递质。突触囊泡对于神经信号的传递至关重要。与突触囊泡相关的疾病有以下几种情况：首先是神经递质失调疾病，突触囊泡负责储存多巴胺、谷氨酸等神经递质，而神经递质的失调与多种相关疾病有关，如帕金森病和阿尔茨海默病等。其次，若突触囊泡的运输受阻或受损，可能会导致神经递质运输障碍的发生。例如，遗传突触囊泡蛋白质缺陷可能导致神经元功能异常，最终引发与运动、认知等相关的疾病。最后，突触囊泡的异常功能与一些精神疾病有关，如精神分裂症和双相情感障碍。这些疾病可能与突触囊泡释放神经递质的异常调控有关。这些疾病的发病机制非常复杂，与突触囊泡的功能异常密切相关。研究突触囊泡的结构、功能和调控机制有助于深入了解疾病的发生和发展，并为开发相关的治疗方法提供理论基础。

3、目前，常用的突触囊泡提取方法主要有超离心法、抗体被动吸附法、分级离心法和可溶性蛋白法。超离心法通过离心过程分离细胞组织，并采用不同离心速度分离突触囊泡，但一些较小颗粒、膜碎片或小泡无法去除，会污染囊泡。抗体被动吸附法利用特异性抗体与囊泡蛋白结合，吸附在固相载体上后洗脱，提取突触囊泡，操作简便但存在特异性问题和囊泡聚集损伤。分级离心法通过多次离心分离不同密度的细胞组分，较轻密度区域通常含突触囊泡，但操作复杂，囊泡纯度低。可溶性蛋白法利用特定蛋白结合突触囊泡进行纯化，例如亲硫醚酯酶，可提高囊泡纯度，但仍需进一步优化和验证。以上方法存在操作复杂、囊泡损伤和污染、纯度较低、特异性不足等缺点。

4、因此，提供一种囊泡损伤小，纯度高的突触囊泡的提取方法显得很有必要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种突触囊泡的提取方法，包括如下步骤：

2、步骤1)：用均质缓冲液，匀浆鼠脑；

3、步骤2)：第一离心，收集第一上清液；

4、步骤3)：对步骤2)得到的第一上清液进行第二离心，收集第二上清液和沉淀；

5、步骤4)：向步骤3)得到的沉淀中加入ddh2o，匀浆；

6、步骤5)：对步骤4)得到的溶液进行第三离心，收集第三上清液，得到上清液；

7、步骤6)：对步骤5)得到的上清液进行第四离心，收集第四上清液；

8、步骤7)：用optiprep密度梯度离心法对步骤6)得到的第四上清液进行纯化；

9、步骤8)：选取囊泡含量最高的一层，过柱洗脱，色谱柱填料为controlled poreglass-bet specific surface area。

10、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤1)中，所述均质缓冲液包括320mm蔗糖、4mm hepes，所述均质缓冲液ph 7.4；所述均质缓冲液中还包括蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂包括pmsf和pepstatin a。

11、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤2)中，第一离心的离心力为900-1100g，离心时间为8-12min。

12、优选地，第一离心的离心力为1000g，离心时间为10min。

13、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤3)中，第二离心的离心力为14000-16000g，离心时间为12-18min。

14、优选地，第二离心的离心力为15000g，离心时间为15min。

15、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤5)中，第三离心的离心力为16000-18000g，离心时间为12-18min；所述步骤5)中进一步包括将所述第三上清液与所述第二上清液合并，得到所述上清液。

16、优选地，第三离心的离心力为17000g，离心时间为15min；

17、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤6)中，第四离心的离心力为47000-49000g，离心时间为20-30min。

18、优选地，第四离心的离心力为48000g，离心时间为25min。

19、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤7)中，用optiprep密度梯度离心法对步骤6)得到的第四上清液进行纯化，包括：配制梯度浓度的optiprep离心液，向离心管中分别加入梯度浓度的optiprep离心液，将所述第四上清液加入梯度浓度的optiprep离心液的最上层，第五离心。

20、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤7)中，离心管中自上到下optiprep离心液的质量浓度依次为：10％、18％、22-27％、30％。

21、优选地，所述步骤7)中，离心管中自上到下optiprep离心液的质量浓度依次为：10％、18％、23.5％、30％。

22、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤8)中，选取囊泡含量最高的一层包括如下步骤：

23、a：vamp2与a450吸光度的标准曲线的建立，将vamp2蛋白按比例稀释成浓度梯度，用酶标仪测定a450吸光度,建立vamp2与a450吸光度的标准曲线；

24、b：bsa与a562吸光度的标准曲线的建立，将bsa按比例稀释成浓度梯度，用酶标仪测定a562吸光度,建立总蛋白与a562吸光度的标准曲线；

25、c：elisa法测定各分层的突触囊泡含量，根据步骤a和步骤b的标准曲线计算vamp2浓度与总蛋白浓度比值，比值越高，即含量越高；

26、在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤8)中，所述洗脱为等度洗脱，洗脱剂流速为0.3ml/min，洗脱液包含250-300mm的甘氨酸，3-7mm的hepes，洗脱液ph为7-8。

27、在本发明的第二方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的提取方法提取得到的突触囊泡。

28、本发明的有益效果在于：

29、1、本发明提供了一种哺乳动物脑突触囊泡的提取方法。通过该方法，可以高效地从哺乳动物脑中提取突触囊泡样品，为突触功能研究和相关领域的发展提供了有力支持。

30、2、本发明提供了上述提取方法提取的突触囊泡，该突触囊泡在蛋白中的含量高，在25％以上，甚至30％以上，突触囊泡纯度高，并且形态完整，没有损伤。

31、3、本发明提出一种从小鼠脑中分离svs的方案，采用差速离心、密度梯度离心和尺寸排阻色谱方法，在不降低囊泡产量的同时保持高纯度。

32、4、本发明还提供了利用提取的哺乳动物脑突触囊泡进行药物筛选或毒性评估的方法。通过将待研究物质与提取的突触囊泡样品接触，并分析其对突触囊泡的影响，可以评估待研究物质对突触功能的调节作用。这为突触研究、药物开发和毒性评估提供了一种快速、可靠的方法，有助于筛选出具有潜在药物活性的化合物或评估药物的安全性。