一种鸡TRIM27.2截短体重组蛋白及制备方法及应用、多克隆抗体及制备方法及应用

本发明属于生物工程，尤其涉一种鸡trim27.2截短体重组蛋白及制备方法及应用、多克隆抗体及制备方法及应用。

背景技术：

1、三方基序(tripartite motif，trim)蛋白的特征在于其保守的n末端ring、b-box和卷曲螺旋结构域，广泛存在于大多数真核生物中，trim基因的总数与生物体的进化程度相关，目前人类中已发现了近80个trim家族蛋白，而鸡中约40个trim蛋白。trim家族成员大多直接参与免疫调节。研究表明，trim蛋白功能多样，但多数trim蛋白的功能包括参与细胞内信号传导、发育、细胞凋亡、蛋白质质量控制、先天免疫、自噬、病毒感染抵抗等。

2、传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,ibdv)引起的鸡的一种重要的免疫抑制性、致死性传染病。患病鸡呈现中枢免疫器官法氏囊急性损伤、b淋巴细胞坏死和免疫抑制，严重影响养禽业的健康发展。ibdv是双rna病毒科、禽双rna病毒属的典型代表，直径50～70nm，无囊膜，具有单层二十面体衣壳。作为一种rna病毒，ibdv突变引起的抗原漂变和免疫逃逸给疫病防控带来了巨大挑战。

3、trim27.2作为三方基序蛋白家族的一员，其n端结构包含ring、b-box和cc形成三基序，鸡trim27.2与人trim27三级结构相似。研究表明人trim27在先天免疫反应中起着重要的调节作用，病毒感染通过shp2募集trim27，通过k48连接的泛素化作用诱导tbk1降解，抑制i型ifn的产生并抑制抗病毒先天免疫反应；il-6显著增加trim27表达，il-6/stat3信号通路可调节银屑病炎症，trim27失调会导致炎症的发生。另一则报道表明trim27具有e3泛素连接酶活性，能够抑制神经细胞增殖且促进癌细胞凋亡。但是，目前关于鸡trim27.2的生物学特性和功能尚无报道，与禽传染性法氏囊病等禽类病毒感染之间的关系也有待阐明。另外，对于鸡trim27.2抗体的制备也尚属空白，更无相关鸡trim27.2多克隆抗体的应用研究。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种鸡trim27.2截短体重组蛋白及制备方法及应用、多克隆抗体及制备方法及应用。该鸡trim27.2截短体重组蛋白，避免了全长表达稳定性的缺点，同时免疫效果更加稳定且抗体水平较高。

2、本发明提供的技术方案如下所示：

3、一种鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

4、以鸡巨噬细胞系hd11总rna反转录后的cdna为模版，进行pcr扩增获得编码鸡trim27.2截短体重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、将扩增获得的编码鸡trim27.2截短体重组蛋白的基因插入到pcoldi载体的酶切位点之间获得重组载体；

6、将所述重组载体转入到感受态细胞中，得到重组菌；

7、将所述重组菌进行培养，当培养液的od_600值为0.6～0.8时，加入iptg进行诱导表达，经分离、纯化、复性，得到鸡trim27.2截短体重组蛋白。

8、进一步的，所述pcr扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：

9、上游引物：5'-ggcatatgctgcctgatctggaaagta-3'

10、下游引物：5'-ccctcgagttacggacacagggtaatct-3'。

11、进一步的，所述编码鸡trim27.2截短体重组蛋白的基因插入到pcoldi载体的酶切位点ndei和xhoi之间获得重组载体。

12、进一步的，所述感受态细胞包括大肠杆菌bl21(de3)。

13、进一步的，所述iptg的浓度为1mmol/l。

14、本发明还提供一种鸡trim27.2截短体重组蛋白，根据上述所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法制得。

15、本发明还提供一种鸡trim27.2的多克隆抗体的制备方法，将上述中的鸡trim27.2截短体重组蛋白作为抗原对动物进行免疫，获得鸡trim27.2的多克隆抗体血清。

16、本发明还提供一种鸡trim27.2的多克隆抗体，根据上述所述的鸡trim27.2的多克隆抗体的制备方法制得。

17、本发明还提供根据上述所述的鸡trim27.截短体重组蛋白、根据上述所述的鸡trim27.2的多克隆抗体在制备检测和/或治疗与鸡trim27.2相关疾病的药物中的应用。

18、进一步的，根据上述的应用，所述与鸡trim27.2相关疾病包括传染性法氏囊病。

19、有益效果

20、本发明的构建的鸡trim27.2截短体重组蛋白，避免了全长表达稳定性的缺点，同时免疫效果更加稳定且抗体水平较高。同时本发明制备的多克隆抗体可应用于鸡trim27.2对ibdv等病毒复制调控的机制研究，具有深远意义，弥补了鸡trim27.2抗体制备及研究的空白，为鸡抗ibdv等病毒感染和免疫调节的机制研究提供新思路。

技术特征：

1.一种鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述pcr扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：

3.根据权利要求1所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述编码鸡trim27.2截短体重组蛋白的基因插入到pcoldi载体的酶切位点ndei和xhoi之间获得重组载体。

4.根据权利要求1所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞包括大肠杆菌bl21(de3)。

5.根据权利要求1所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述iptg的浓度为1mmol/l。

6.一种鸡trim27.截短体重组蛋白，其特征在于，根据权利要求1-5任一项所述的鸡trim27.2截短体重组蛋白的制备方法制得。

7.一种鸡trim27.2的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求6中的鸡trim27.2截短体重组蛋白作为抗原对动物进行免疫，获得鸡trim27.2的多克隆抗体血清。

8.一种鸡trim27.2的多克隆抗体，其特征在于，根据权利要求7所述的鸡trim27.2的多克隆抗体的制备方法制得。

9.根据权利要求6所述的鸡trim27.截短体重组蛋白、权利要求8所述的的鸡trim27.2的多克隆抗体在制备检测和/或治疗与鸡trim27.2相关疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述与鸡trim27.2相关疾病包括传染性法氏囊病。

技术总结本发明属于生物工程技术领域，尤其涉一种鸡TRIM27.2截短体重组蛋白及制备方法及应用、多克隆抗体及制备方法及应用，包括以下步骤：以鸡巨噬细胞系HD11总RNA反转录后的cDNA为模版，进行PCR扩增获得编码鸡TRIM27.2截短体重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将扩增获得的编码鸡TRIM27.2截短体重组蛋白的基因插入到pColdI载体的酶切位点之间获得重组载体；将所述原核表达载体转入到感受态细胞中，得到重组菌；将所述重组菌进行培养，当培养液的OD_600值为0.6～0.8时，加入IPTG进行诱导表达，经分离、纯化、复性，得到鸡TRIM27.2截短体重组蛋白。本发明构建的鸡TRIM27.2截短体重组蛋白，避免全长表达不稳定的缺点，同时免疫效果更加稳定且产生的抗体水平较高，制备的鸡TRIM27.2的多克隆抗体能用于验证TRIM27.2对IBDV等病毒复制调控的机制。技术研发人员：陈世豪,尹娜,吴双,王佳兴,白皓,常国斌,陈国宏受保护的技术使用者：扬州大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18