一种生产麦角酸的酵母基因工程菌株及其构建方法

本发明涉及生物，特别涉及一种生产麦角酸的酵母基因工程菌株及其构建方法。

背景技术：

1、麦角生物碱主要是曲霉(aspergillus)，麦角菌属(claviceps)，以及内生真菌(neotyphodium)这三类真菌的次生代谢产物，它是一类具有较强药理活性的真菌类吲哚类生物碱天然产物，是治疗偏头痛、子宫出血、帕金森症和其他疾病的治疗药物的原料。生物碱类药物通常从植物提取的起始原料中半合成，这往往限制了它们的可用性和最终价格。近年来合成生物学的进展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物生物碱成为可能。微生物生产改性生物碱具有加速生物碱类药物半合成的潜力，它提供了结构上更接近最终药物的高级中间体，可作为新型药物合成的高级中间体。

2、麦角生物碱合成的源头底物为色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)，尽管目前其生物合成路径中的共同前体可以确定为裸麦角碱，但是裸麦角碱的下游合成路径并不是十分清晰，具体的催化机理，反应机制不清楚。而涉及chanoclavine-i形成的一共需要四个酶，分别为dmaw和easf、ease和easc，dmaw和easf这两步酶不是限制chanoclavine-i形成的因素，关键是ease和easc的研究。2014年，curt af nielsen等研究者成功地在酿酒酵母中以色氨酸和dmapp合成了裸麦角碱，筛选到来自日本曲霉的ease和easc这两个蛋白实现了裸麦角碱的合成，使得ease和easc在酵母异源中表达成为可能，关键酶ease和easc的研究依赖于真菌的基因互补，但进一步的表征则受到ease蛋白表达困难的阻碍。最终发现ease的n端er靶向信号肽对在酵母中表达活性有影响，研究者对ease信号肽做了截短验证，并没有将其他酶共同作细胞器定位尝试。2015年，dorota jakubczyk等研究者在酿酒酵母中实现了从头合成cycloclavine，裸麦角碱的一步下游产物，通过增加了三个拷贝数的dmaw、四个拷贝数的easc实现了cycloclavine产量为529mg/l，裸麦角碱产量为0.75mg/l，平行副产物羊茅麦角碱89mg/l，发酵优化发现低温22℃对ease和easc催化速率有明显提高使得chanoclavine-i产量翻了十几倍。2010年，johnathan z.cheng等研究者发现在麦角生物碱合成路径中easa是一个重要的分支控制点，序列比对发现easa与黄素酶高度同源，easa负责两个功能分别为异构化和还原性。2011年，marco matuschek等研究者通过在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白easg，体外通过控制还原性谷胱甘肽(gsh)的量与nadph，裸麦角碱醛混合孵育，最终获得田麦角碱。在麦角生物碱合成路径中gsh替代了easa的作用，对此说明easa的具体催化机理或者说裸麦角碱醛到田麦角碱的催化机制依然是不清楚的。2019年，yongpeng yao等研究者又进一步解析了easc的催化反应机制，easc主要负责麦角生物碱中心碳环的生物合成，研究者提出自由基理论，解释了easc的双功能——过氧化氢酶和单加氧酶功能。到目前为止，在异源宿主中进行合成田麦角碱的难度在于easa酶的功能分配，还原性功能的表达将裸麦角碱醛流向羊茅麦角碱，已实现了89mg/l的滴度。2021年，yongpengyao等研究者又在构巢曲霉中通过优化p450电子转移途径和cloa的拷贝数实现了麦角酸的异源合成。2022年garrett wong等研究者通过使用酶功能初始化-酶相似度工具(efi-est)，寻找途径酶(ease、easa和cloa)的同源基因在工程酿酒酵母中重建通路，最终在1l生物反应器中生产了滴度为1.7mg/l的麦角酸。

3、在麦角生物碱生物合成途径中负责将田麦角碱催化合成麦角酸的途径酶cloa属于p450酶，其符合大部分p450酶的共性瓶颈问题即存在低表达和催化活性差的问题。其中正确的蛋白折叠能有效保证蛋白的表达量，蛋白质折叠在很大程度上取决于复杂的分子伴侣网络。在胞质溶胶中，不同类别的分子伴侣在进化保守的折叠途径中合作。其次分子伴侣还可通过控制蛋白质组健康以支持细胞稳态。在真核生物中，蛋白二硫键异构酶(pdi)是内质网(er)中的主要蛋白质之一。它作为伴侣，有助于新生蛋白质中二硫键的形成、恢复和异构化。蛋白质伴侣ssa1影响着mrna与线粒体的结合，ssa1耗竭降低了mrna与线粒体的结合，而其过表达增加了mrna的结合。同时ssa蛋白优先影响编码疏水蛋白的mrna，疏水蛋白是这些蛋白质伴侣的预期靶标。srp54作为信号识别分子蛋白，可促进靶向内质网的共翻译蛋白的信号肽结合。hsp70家族成员通过结合和释放非天然蛋白，促进蛋白质折叠、再折叠和降解，在细胞蛋白质代谢中发挥重要作用。hsp40(dnaj样蛋白)家族成员是hsp70的共同伴侣，通过促进蛋白质折叠、组装和降解来决定hsp70的命运。hsp40通过利用内在伴侣活性结合蛋白质的非天然区域为hsp70选择底物。热休克蛋白90(hsp90)是一种分子伴侣，可折叠和重塑蛋白质，从而调节多种底物蛋白的活性。在原核生物中同样存在一套完整的分子伴侣系统。一些常见的分子伴侣和折叠酶包括dsba、skp、fkpa、groel/es、grpe等。提供一种采用分子伴侣蛋白提高基因工程菌株的麦角酸产量的方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种优化生产麦角酸重组酿酒酵母菌株(saccharomycescerevisiae)的方法，通过优化筛选真核生物和原核生物来源的分子伴侣蛋白促进了以酿酒酵母为底盘合成麦角酸的产量。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了分子伴侣蛋白在提高重组酿酒酵母的麦角酸产量中的应用；

4、所述分子伴侣蛋白包括groes、groel、grpe、dsba、skp、fkpa、hsp40、pdi1、sarp54、ssa1或hsp90；

5、所述重组酿酒酵母为sybe_sc06130247。

6、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的所述分子伴侣蛋白包括groes(seqidno:5)、groel(seq id no:6)、grpe(seq id no:7)、dsba(seq id no:8)、skp(seq id no:9)、fkpa(seq id no:10)、hsp40(seq id no:11)、pdi1(seq id no:12)、sarp54(seq idno:13)、ssa1(seq id no:14)或hsp90(seq id no:15)。

7、本发明还提供了表达盒，包括：

8、(1)、fba1t-pgal110-groes-tdh2t；或

9、(2)、fba1t-pgal110-groel-tdh2t；或

10、(3)、fba1t-pgal110-grpe-tdh2t；或

11、(4)、fba1t-pgal110-dsba-tdh2t；或

12、(5)、fba1t-pgal110-skp-tdh2t；或

13、(6)、fba1t-pgal110-fkpa-tdh2t；或

14、(7)、fba1t-pgal110-hsp40-tdh2t；或

15、(8)、fba1t-pgal110-pdi1-tdh2t；或

16、(9)、fba1t-pgal110-sarp54-tdh2t；或

17、(10)、fba1t-pgal110-ssa1-tdh2t；或

18、(11)、fba1t-pgal110-hsp90-tdh2t。

19、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达盒中所述fba1t的序列如seq id no:24所示，所述pgal110的序列如seq id no:25所示，所述tdh2t的序列如seq id no:26所示，所述groel的序列如seq id no:5所示，所述groel的序列如seq id no:6所示，所述grpe的序列如seq id no:6所示，所述dsba的序列如seq id no:8所示，所述skp的序列如seq idno:9所示，所述-fkpa的序列如seq id no:10所示，所述hsp40的序列如seqid no:11所示，所述pdi1的序列如seq id no:12所示，所述sarp54的序列如seq id no:13所示，所述ssa1的序列如seq id no:14所示，所述hsp90的序列如seq id no:15所示。

20、本发明还提供了表达载体，包括上述表达盒，以及可接受的基因元件。

21、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体骨架为prs416。

22、本发明还提供了基因工程菌株，构建方法包括：取上述表达盒或上述表达载体导入重组酿酒酵母sybe_sc06130247。

23、本发明还提供了上述基因工程菌株的构建方法，包括取上述表达盒或上述表达载体通过醋酸锂转化法导入重组酿酒酵母sybe_sc06130247，获得所述基因工程菌株。

24、本发明还提供了所述基因工程菌株在制备麦角酸中的应用。

25、本发明还提供了合成麦角酸的方法，包括以重组酿酒酵母sybe_sc06130247为底盘共表达分子伴侣蛋白，获得基因工程菌株，培养所述基因工程菌株，获得麦角酸；

26、所述分子伴侣蛋白包括groes、groel、grpe、dsba、skp、fkpa、hsp40、pdi1、sarp54、ssa1或hsp90。

27、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：取如权利要求2所述的表达盒或如权利要求3或4所述的表达载体导入重组酿酒酵母sybe_sc06130247，获得基因工程菌株，培养所述基因工程菌株，获得麦角酸。

28、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法取如权利要求2所述的表达盒或如权利要求3或4所述的表达载体通过醋酸锂转化法导入重组酿酒酵母sybe_sc06130247，获得基因工程菌株，培养所述基因工程菌株，获得麦角酸。

29、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用、基因工程菌株或方法中所述sybe_sc06130247的构建方法为：采用crispr技术将tdh2t-easg_cp-pgal110-easa_cf-fba1t整合到sybe_sc06130019的ho位点，用于靶向ho位点的sgrna序列为gacgaccaggtcagctaggg(seq id no:27)，通过色氨酸营养选择性标签作为筛选压力将tdh2t-cpcloa-gal110-cpcpr-fba1t整合到sybe_sc06130019的xiii染色体的ymrwδ15位点处；

30、所述sybe_sc06130019为专利cn202110467433.8中的所述sybe_sc06130019；

31、所述tdh2t-easg_cp-pgal110-easa_cf-fba1t为专利cn202110467433.8中的所述tdh2t-easg_cp-pgal110-easa_cf-fba1t。

32、本发明的酵母基因工程菌株及其构建方法有如下效果：

33、本发明确定了生物合成麦角酸的酿酒酵母菌株中共表达分子伴侣蛋白有利于提高其产量，也进一步证明了分子伴侣的过表达有利于提高蛋白质组健康进而促进有效酶的表达，为后续继续优化提产麦角酸提供了有利证据，也为以麦角酸为前体生物合成其他麦角生物碱类物质提供了一个高产底盘。