一种具有免疫调节活性的昆布多糖的制备及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种具有免疫调节活性的昆布多糖的制备及其应用。

背景技术：

1、昆布为海带科植物海带或翅藻科植物黑昆布的叶状体，具有软坚散结，消痰，利水之功效，其主要成分为多糖、天然蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质和核酸等，具有明显的药理学作用。随着海洋生物资源的不断开发，昆布作为重要的海洋产物，其生物活性价值引起了国内外学者的关注，我国对昆布的研究主要集中在昆布多糖、褐藻胶、粗提碘等方面。昆布多糖是昆布最主要活性成分之一，由d-吡喃葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接而成，具有三螺旋结构。

2、随着生活压力的不断增加，人们的饮食结构越发不合理，高糖、高脂肪、高盐食物摄入过多等饮食习惯引发了一系列肠道问题，这些问题严重威胁肠道以及身体的健康。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)是一种以腹痛、腹泻和黏液脓血便为主要特征的慢性炎症性肠病，病程长且反复发作，严重影响患者的生活质量。目前临床认为uc病因复杂，主要涉及肠道微生物、肠黏膜屏障、免疫反应等。现有研究表明肠道肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素12(il-12)等促炎细胞因子与il-4、il-10等抗炎细胞因子的失衡在uc的发展中起到关键作用。巨噬细胞分为m1(经典活化)型和m2(交替活化)型，在免疫调节方面伴有重要角色，uc患者体内巨噬细胞被过度激活，产生大量促炎细胞因子。且因肠道长期处于炎症状态，导致肠黏膜屏障受损，肠壁通透性增加。cd68和cd163是典型的巨噬细胞标志物，参与免疫反应和炎症过程。cd68通常用于标记m1型巨噬细胞，这些巨噬细胞与促炎症反应相关。相反，cd163通常用于标记m2型巨噬细胞，这些巨噬细胞与抗炎症和组织修复相关。因此，通过调节巨噬细胞m2/m1极化，将有助于改善uc。

3、公告号为cn 104640883 a的中国专利公开了一种用于制备多糖衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在至多70℃的温度下便至少一种多糖与至少一种多糖溶胀剂接触；和(b)随后，使步骤(a)的产物与至少一种芳族异氨酸醋接触；从而制备多糖衍生物。所述的多糖包括昆布多糖。但所述的制备多糖衍生物的具体内容中并没有公开乙酰化昆布多糖的技术方案。

4、公告号为cn 103841979 a的中国专利公开了一种促凝血量的非抗凝血的硫酸多糖(nasp)，所述nasp包括化学硫酸化的昆布多糖。但该技术方案提供的吸收促进剂的用途是“联合胃肠道上皮屏障渗透促进剂，以足以增强受试者的血液凝固”，既没有提供一种乙酰化昆布多糖，也没有提供一种调控炎症因子和巨噬细胞标志物表达的产物。

5、目前临床上治疗uc的药物有环孢素类、5-氨基水杨酸药物、类固醇和免疫抑制剂等，虽有一定的治疗效果，但这些药物的长期使用会导致过敏、腹泻、腹痛等多种不良反应而限制了其应用。因此，有效且毒副作用低的天然来源药物的开发受到了人们越来越多的关注，研究一种通过免疫调节来缓解炎症性肠病的药物对炎症性肠病的治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提出一种具有对炎症因子和巨噬细胞标志物调控作用的乙酰化昆布多糖及其制备方法与应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题。

2、本发明第一方面在于提供一种乙酰化昆布多糖。

3、本发明第二方面在于提供本发明第一方面所述乙酰化昆布多糖的制备方法。

4、本发明第三方面在于提供本发明第一方面所述乙酰化昆布多糖在制备药物或食品中的应用。

5、本发明第一方面所述乙酰化昆布多糖如式(1)所示：

6、

7、其中：n为1～100之间的整数。

8、本发明以昆布多糖为主体原料，通过对昆布多糖乙酰化，在昆布多糖分子结构上引入乙酰基，以获得乙酰化昆布多糖。昆布为海带科植物海带或翅藻科植物黑昆布的叶状体，具有软坚散结，消痰，利水之功效，其主要成分为多糖、天然蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质和核酸等，具有明显的药理学作用。昆布多糖是昆布最主要活性成分之一，是膳食多糖中的一种，而膳食多糖发挥的生物活性又与其结构特征(如基团种类和数量、分子量、组成糖、糖苷键类型及连接顺序等)密切相关，不同结构的膳食多糖，其生物活性也存在一定的差异。本发明在昆布多糖分子的基础上对昆布多糖进行乙酰化，改变了昆布多糖的空间结构，引发了昆布多糖的活性变化，通过分析乙酰化昆布多糖对炎症因子和巨噬细胞标志物表达具有调控作用，证实了具有式(1)结构的乙酰化昆布多糖对炎症因子和巨噬细胞标志物表达具有调控作用，有效缓解溃疡性结肠炎的肠道炎症反应。

9、本发明第二方面所述乙酰化昆布多糖的制备方法包括以下步骤：

10、(1)将昆布粉末进行真空干燥，得固体产物；

11、(2)所述固体产物加入到三氟乙酸酐(trifluoroacetic anhydride，tfaa)和醋酸(acetic acid)的溶液中，充分搅拌，得反应液；

12、(3)将所述反应液加入蒸馏水，离心，去除上清液，沉淀干燥后得残留物；

13、(4)将所述残留物用蒸馏水进行复溶；

14、(5)将步骤(4)获得的复溶溶液透析后，冷冻干燥，即得乙酰化昆布多糖。

15、制备过程的中合成线路如下：

16、

17、其中laminarin acetate(la)即为所述乙酰化昆布多糖。

18、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(1)所述真空干燥条件为60～80℃；优选地，所述真空干燥条件为70℃。所述真空干燥持续2小时。

19、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(2)所述固体产物、tfaa和醋酸的用量比例为1g:(35～45)ml:(10～15)ml。优选地，步骤(2)所述固体产物、tfaa和醋酸的用量比例为1g:40ml:12ml。

20、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(2)所述搅拌条件为40～50℃，持续0.5～2小时。优选地，步骤(2)所述搅拌条件为45℃下持续1小时。

21、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(3)所述反应液与蒸馏水的体积比为1:(3～5)。优选地，所述反应液与蒸馏水的体积比为1:4。

22、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(3)所述离心条件为10000rpm，持续15分钟。

23、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(3)所述干燥条件为50～70℃，持续2～4小时。优选地，所述干燥条件为60℃，持续3小时。

24、在本发明第二方面的一些应用实施方式中，步骤(5)所述透析条件为使用截留分子量为1.4kda的透析袋透析24h。

25、本发明第三方面提供所述乙酰化昆布多糖在制备预防/缓解/治疗溃疡性结肠炎的药物或食品中的应用。

26、本发明的第三面提供了所述褐藻多糖在制备预防/治疗肝脏损伤的药物或食品中的应用。

27、本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：

28、本发明利用硫酸葡聚糖酸钠(dss)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，进行了基于调控炎症因子和巨噬细胞标志物表达的乙酰化昆布多糖在缓解小鼠溃疡性结肠炎的调控机制分析实验。结果证明乙酰化昆布多糖降低了促炎因子(如ifn-γ、il-6、tnf-α、il-1β)的表达，增加了抗炎因子(如tgf-β1、il-10)的表达，对溃疡性结肠炎小鼠体内促炎-抑炎因子的平衡具有明显的积极作用；乙酰化昆布多糖对溃疡性结肠炎小鼠体内巨噬细胞标志物(cd68和cd163的比值)具有调节作用，其可能通过影响肠道中的m1型巨噬细胞转变成m2型，提高m2/m1比例从而调节促-抑炎因子的产生来缓解uc小鼠症状。为化学修饰后的昆布多糖在缓解溃疡性结肠炎的应用提供了科学依据。同时，本发明的制备方法简单，不需要经过复杂的化学合成反应，且反应产物较为单一，产率高，适用于产业化规模生产。