产L-苏氨酸的基因工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地说，涉及产l-苏氨酸的基因工程菌及其应用。

背景技术：

1、l-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前l-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于l-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

2、随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国cj株式会社申请的中国专利cn03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrabc表达，苏氨酸生产力提高22％。kwang ho lee(kwang ho lee等,systems metabolic engineering ofescherichia coli for l-threonine production,mol syst biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶i和iii的基因thra、lysc解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilva来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因meta和lysa为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的th28c(pbrthrabcr3)菌株发酵50h可产酸82.4g/l，糖酸转化率39.3％。cn105543156a通过强化thra*bc、敲除tdh获得mhz-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/l、转化率约为8.9％，且无质粒负担。cn106635945a通过在大肠杆菌中强化pntab基因和异源引入pyc基因获得mhz-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/l、转化率约为16.2％且无质粒负担。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型的产l-苏氨酸的基因工程菌及其应用。

2、本发明构思如下：本发明首先构建了一株具备生产苏氨酸能力的菌株，谷氨酸棒状杆菌中与苏氨酸合成路径相关的酶(主要为丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶)的表达被强化，从而提高谷氨酸棒状杆菌的氨基酸生产能力，特别是l-苏氨酸的生产能力；在此基础上，进行生物素合成bira基因的表达强化，以进一步提高苏氨酸的生产能力。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供产l-苏氨酸的基因工程菌，所述产l-苏氨酸的基因工程菌是采用基因工程手段，通过强化菌株的生物素合成路径获得的基因工程菌。

4、所述菌株为具有苏氨酸生产能力的菌株，优选棒杆菌属(corynebacterium)中的细菌，更优选谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)。

5、所述基因工程菌为：通过增强谷氨酸棒状杆菌中的基因bira(ncbi编号：cg0814、cgl0709、ncgl067)，获得的基因工程菌。

6、增强的途径可选自以下1)～3)中的至少一种：

7、1)通过将强启动子与生物素合成基因可操作地连接而增强；

8、2)通过增加染色体上生物素合成基因的拷贝数而增强；

9、3)通过增加染色体上生物素合成基因启动子的rbs序列的强度而增强。

10、考虑到基因表达强化及弱化无法通过举例穷尽，本发明仅做示例性列举，实际操作时技术人员可根据具体情况做适应性调整，因此本发明所指强化及弱化包括但不限于实施例中公开的内容。

11、所述强启动子可选自ptac、plac、ptrp、ptrc、psod等。

12、进一步地，所述谷氨酸棒状杆菌为模式菌株经过天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶等中的至少一个表达强化的菌株。

13、第二方面，本发明提供产l-苏氨酸的基因工程菌的构建方法，利用基因工程手段将强启动子psod与谷氨酸棒状杆菌中的bira可操作的连接，达到bira基因表达强化的目的。

14、第三方面，本发明提供按照上述方法构建得到的产l-苏氨酸的基因工程菌。

15、第四方面，本发明提供所述基因工程菌，或按照上述方法构建的基因工程菌在发酵生产l-苏氨酸中的应用。

16、本发明中关于生物素合成路径的基因的表达强化仅做了部分举例，本领域技术人员可进行一定程度的改变以增强其合成路径，包括但不限于解除反馈抑制、启动子强化、核糖体结合位点强化、拷贝数增加等，以上手段均可以增强生物素合成路径的强化，均属于本发明的保护范围。

17、此外，谷氨酸棒状杆菌中丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶的表达被强化同样包括但不限于解除反馈抑制、启动子强化、核糖体结合位点强化、拷贝数增加等。

18、此外生产苏氨酸的棒状杆菌不限于谷氨酸棒状杆菌，其工程改造可以为上述丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶这几个酶的组合。

19、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

20、本发明通过强化l-苏氨酸生产菌株的生物素合成，所采用的具体手段为强化bira基因表达、增加拷贝数等。构建得到的产l-苏氨酸的基因工程菌，经发酵培养，l-苏氨酸产量可达8.3g/l，糖酸转化率可达27.8％。本发明同样适用于提高天冬氨酸家族氨基酸如天冬氨酸、赖氨酸、高丝氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等的产量和糖酸转化率。此外，本发明也适用于其他以生物素作为辅因子的酶提高酶活从而增强氨基酸的合成路径。

技术特征：

1.产l-苏氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述产l-苏氨酸的基因工程菌是采用基因工程手段，通过强化菌株的生物素合成路径获得的基因工程菌；

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，通过增强谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)中编码ncbi参考序列cg0814、cgl0709、ncgl067的基因bira，获得的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，增强的途径选自以下1)～3)中的至少一种：

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子选自ptac、plac、ptrp、ptrc、psod。

5.根据权利要求1-4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为模式菌株经过天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶中的至少一个表达强化的菌株。

6.产l-苏氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段将强启动子psod与谷氨酸棒状杆菌中的基因bira可操作地连接。

7.按照权利要求6所述方法构建得到的产l-苏氨酸的基因工程菌。

8.权利要求1-5或权利要求7任一项所述基因工程菌在发酵生产l-苏氨酸中的应用。

技术总结本发明公开了产L‑苏氨酸的基因工程菌及其应用。本发明通过强化L‑苏氨酸生产菌株的生物素合成，采用的具体手段为强化birA基因。构建得到的产L‑苏氨酸的基因工程菌，经发酵培养，L‑苏氨酸产量可达8.3g/L，糖酸转化率可达27.8％。技术研发人员：刘慧敏,尹春筱,康培受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13