合成多肽的制作方法

专利名称：合成多肽的制作方法技术领域：本发明涉及合成的多肽。特别是涉及模拟病毒衣壳蛋白特定区域之三维结构和/或静电表面和/或其他物理、化学及结构特性的合成多肽。特别引起人们兴趣的是可据此设计与获得性免疫缺陷综合症(爱滋病)之致病因子，即人类免疫缺陷病毒(HIV)有关的疫苗、免疫学活性治疗剂、诊断及其他医学或科学试剂。近十年来，爱滋病已成为全世界范围内的重要医学问题，并且近来越发迫切需要用于研究、诊断、治疗和/或预防由该疾病的致病因子即HIV引起之感染的试剂或药剂。利用已知由HIV和HIVⅡ病毒产生之蛋白质的氨基酸序列(如参见，Rather，L.etocl，Nature 313，277(1985);Meusing，M.A.etal、Nature 313，450(1985);Wain-Hobson，S.etal.，Cell40，9(1985))，已有可能设计出模拟病毒衣壳蛋白之抗原特性的合成多肽。本发明的一个目的是发展可引发抗HIV病毒抗体，更好是中和抗体产生的合成多肽，即所说的抗体可通过被动或主动免疫来预防HIV病毒感染和/或HIV病毒播散。用这类抗体进行被动免疫可作治疗爱滋病病人的有效手段，从而控制病毒在病人个体内或个体之间传播，进而减慢或阻止病性进展。本发明提供了至少有一种人类免疫缺陷病毒(HIV)毒株之至少一种衣壳蛋白抗原特性的合成多肽，所说的多肽基本上由下列式(Ⅰ)的氨基酸序列构式X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Trp-Gly-Cys-R8-R9-R10-R11-R12-Cys-Y (Ⅰ)其中R1是ASP或Glu;R2是选自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asn或Gln的氨基酸残基;R3是选自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Lys、His、Gln或Arg的氨基酸残基;R4、R5和R11各自是任何氨基酸残基;R6和R8各自是选自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr或Asn的氨基酸残基;R7是选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met或Pro的氨基酸残基;R9和R12各自是选自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸残基;R10是选自Lys、His或Arg的氨基酸残基;且X和Y各自可以是不存在的，或者各自是一个或多个，如3个额外的氨基酸残基。没有X和Y的上述式Ⅰ的肽，当然是有用的，例如用于生产抗HIV抗体。但当存在X或Y时，它们可以是任何长度的，较好少于20个氨基酸，更好少于10个，如3至6个氨基酸。当然，比较合适的是在式Ⅰ的序列构成的蛋白质中，X和Y为该蛋白质的主要部分，抗原序列则为例如球蛋白的裸露环上的一部分。优选的是，R2选自Gln或Thr，R3选自Ser、Asn、Gln、Arg或Ala，R4选自Leu、Ile、Gln或Arg，R5是Leu或Lys，R6是Gly或Asn，R7选自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp或Ser，R8是Ser或Ala，R9是Gly或Phe，R10是Arg或Lys，R11选自Leu、His、IleGln，R12选自Ala、Ile或Val。10和16位上的Cys残基可以是或不是由分子内二硫桥键连接的。本发明之多肽的一种优选形式是其基本上由式(Ⅱ)的氨基酸序列构成X-Asp-Gln-R3-Leu-R5-Gly-R7-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y (Ⅱ)其中R3、R5、R11、R12、X和Y定义同上，且R7是选自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、MetCys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸残基。根据式(Ⅱ)的序列，较好是R3选自Ser、Asn、Gln和Arg，R11选自Leu、His或Ile，且R12是Ile或Ala。更有利的是，R7选自Ile、Phe、Met、Val或Leu。最好R3是Ser或Asn或Asn，且R5是Lys。根据本发明的式(Ⅱ)多肽的优选形式是由下示序列构成X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y定义同上，且10和16位上的Cys残基可以是由分子内二硫桥键连接的。式(Ⅱ)多肽的另一个优选形式包括R3选自Gln或Arg，R5是Leu，R7选自Ile、Phe和Met，R11选自LeuHis或Ile且R12为Ala。优选序列具有下列结构式X-Asp-Gln-Ser-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y定义同上，且处于10和16位上的Cys残基可以是由分子内二硫桥键连接的。根据式Ⅱ的多肽组装成HIVI衣壳蛋白的某些抗原决定基部分。根据本发明之多肽的另一个优选形式基本上由式(Ⅲ)的氨基酸序列构成X-R1-R2-R3-R4-R5-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲ)其中R1是Glu或Asp;R2是Thr或Gln;R3是选自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸;R4是选自Leu、Arg、Ile或Gln的氨基酸;R5是Lys或Leu，且其中X和Y定义同上，处于10和16位上的Cys残基可以是或不是由分子内二硫桥键连接的。根据式(Ⅲ)之多肽的一个优选形式是它基本上由下列式(Ⅲa)的氨基酸序列构成X-Glu-Thr-R3-R4-Lys-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲa)其中R3是选自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸残基，R4是选自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸残基，X和Y定义同前，且处于10和16位上的Cys残基可以是或不是由分子内二硫桥键连接的。当R4是Ile时，R3较好是Ser，且当R3是Ala时，R4较好是Arg或Gln，但更好是Arg。根据式Ⅲ的多肽相似于HIVⅡ衣壳蛋白的某些抗原决定基。本发明的优选多肽序列是基于它们与HIV衣壳蛋白的一个以上抗原决定基的细部结构相似性而被选择的。例如，最初被设计成某抗原决定基之结构类似物的给定多肽，可能由于祖先基因的复制、或因为该多肽是不连续抗原决定基的结构类似物，或因为这些多肽已被设计为多价的，所以也可显示出与HIV衣壳蛋白之一个或多个其他区域的局部结构相似性。不连续抗原决定基可以看作是由密切相对的序列抗原决定基组成的，就它们自身的作用来说可以是有其抗原意义的，而且一个多价多肽可在单一多肽链上含有两个或多个(连续或不连续的)抗原决定基类似物，从而为同时诱发产生一系列抗体，用以识别HIV衣壳蛋白上的两个或多个抗原决定基。例如，可使用常规的9-芴基-甲氧基羰基(F-Moc)化学(如参见Atherton，E.and Sheppard，R.C.(1985)J.Chem.Soc.Chem.Comm.165)或常规丁氧基碳酸酯(T-Boc)化学来合成本发明的肽。应仔细检查结构的正确性和纯度水平(一般应在85%以上)，而且当存在分子内二硫桥键时，还应特别注意其排布的正确性。可使用各种层析分析法(包括高效液相层析)及光谱分析法(包括拉曼光谱分析)来达到这一目的。本文所有序列中均使用标准的I.U.P.A.C.三字母代码缩写符来表示如下限定的氨基酸残基Gly-甘氨酸，Ala-丙氨酸，Val-缬氨酸，Leu-亮氨酸，Ile-异亮氨酸，Ser-丝氨酸，Thr-苏氨酸，Asp-天冬氨酸，Glu-谷氨酸;Asn-天冬酰胺，Gln-谷氨酰胺，Lys-赖氨酸，His-组氨酸，Arg-精氨酸，Phe-苯丙氨酸，Tyr-酪氨酸，Trp-色氨酸，Cys-半胱氨酸，Met-蛋氨酸，Pro-脯氨酸。本发明的多肽或其抗体可以单独使用或与其他药剂合用，如3′叠氮基-3′-脱氧胸苷(AZT)(Zidovudine)-其可通过干扰病毒遗传材料的复制在不同水平上发挥作用，和/或HIV蛋白酶抑制剂-其可阻断病毒发育所必需之酶的作用。本发明的多肽可用于产生抗体，而所说的抗体可以与广泛的HIV-1和/或HIVⅡ病毒株产生的衣壳蛋白有交叉反应。我们的分析表明，鉴于本发明之多肽的构象/局部结构/静电特性，故它们极可能诱发产生可与几个或许多个病毒株之HIV衣壳蛋白有交叉反应的抗体，并且可能将几个变异多肽的优点结合于一个较大多肽中。这样的多肽可具有下列通式(Ⅳ)〔La-F〕m-〔Lb-G〕n-Lc(Ⅳ)其中F和G各自可以是根据式Ⅰ至Ⅲa之一的多肽，L是连接序列，a、b和c各自是0或1，m和n各自是1和10之间的正数。L较好是短的、构象上可曲拆的多肽链的小片段，例如但不限于Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。应明确的是，各重复部分可以有或没有根据本发明之多肽的不同变异体。由式Ⅳ限定的多价抗原决定基类似物是指假均多价的(pseudohomopolyvalent)类似物，其中在单一多肽链内重复出现基本上同一抗原决定基类似物的变异体。此外，简单的均质多价多肽免疫原-其含有根据式Ⅰ至Ⅲa之一的一个抗原决定基类似物之同样变异体的多个拷贝-也可望是有效的，并且也包括于本发明的范围之内。可望假均多价免疫原多肽作为疫苗是特别有价值的，它们可引发产生一系列有相似但不完全相同之基本特异性的(中和)抗体，它们与多种HIV病毒株的衣壳蛋白之间有交叉反应，因而就保护免疫力来说是更为有效的。就构建异质多价多肽来说也有其多方面的优点，所说的异多价多肽含有以任何次疗存在的、根据本发明之一种多肽的一个或多个拷贝，以及抗原决定基类似物的一种或多种其他类似物。本发明提供的这类多肽具有下列通式(Ⅴ)Ld-〔G-L〕m-F-〔L-G〕n-Le(Ⅴ)其中F是根据式Ⅰ至Ⅲa的任何一种多肽，G是根据式Ⅰ至Ⅲa或其他序列的任何一种多肽，m和n各自是如1和10之间的正数，且d和e各自是0或1。“L”较好是多肽链的短的，构象上可拆曲的小片段，例如但不仅限于Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。在肽Ⅴ的优选形式中，G可包括式Ⅰ至Ⅲa中之一或下示序列的多肽X-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Gly-Gly-Glu-Leu-Y其中各个Gly可独自地被任何其他氨基酸所取代，和/或X与Y可各自是不存在的或者是一个或多个，如三个氨基酸残基。或者，G可包括一些与HIV抗原蛋白相关的其它多肽序列。应明确的是，保留了亲代多肽之一般形式和功能的、上面鉴定之多肽序列的抗原上有意义的亚片段和/或抗原上有意义的变异体，也包括于本发明的范围内。具体地说，用有差不多构象和/或物理特性的残基取代任何特定的残基，包括用罕见的(但是天然存在的，如D-立体异构体)或合成的氨基酸类似物取代者，也包括在本发明范围内。例如，被如下限定的同一组中的另一氨基酸取代即包括在本发明的范围内;1组-Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp和Met;2组-Ser、Thr、Asn和Gln;3组-Asp和Glu;4组-Lys、His和Arg;5组-Asn和Asp;6组-Glu和Gln;7组-Gly、Ala、Pro、Ser和Thr。所有氨基酸类型的D-立体异构型均可被取代，如D-Phe、D-Tyr和D-Trp。本发明的优选方案中，如果X和Y存在的话，它们各自独立地包括蛋白质序列的一个或多个片段，这些片段具有与T-细胞抗原决定基相同的能力。例如，通式1-2-3-4之氨基酸序列的各小片段、其中1是Gly或带电荷的氨基酸(如Lys、His、Arg、Asp或Glu)、2是疏水氨基酸(如Ile、Leu、Val、Met、Tyr、Phe、Trp、Ala)、3是疏水氨基酸(如上限定的)或不带电荷的极性氨基酸(如Asn、Ser、Thr、Pro、Gln、Gly)，且4是极性氨基酸(如Lys、Arg、His、Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、ThrPro)，似乎可至少在某些情况下作为T细胞抗原决定基(Rothbard，J.B.&amp;Taylor，W.R.，(1988)A Sequence pattern in common to T-Cell epitopes The EMBO Journal，7(1)93-100)。相似小片段可以是序列1′-2′-3′-4′-5′的小片段，其中1′是等同于上面限定的1，2′等同于2，3′和4′等同于3，而5′等同于4(文献同上)。两种形式均包括于本发明的范围内，且均可作为1个或多个T细胞抗原决定基(最好少于5个)，其可以是上面限定的类型或有其他结构，且可以被具有任何长度或组成的、但较好是少于5个氨基酸(长度)并包括如选自Gly、Ala、Pro、Asn、Thr、Ser之残基或非α氨基酸等多功能连接子的间隔基分离开的。有可能借助C或N未端连接子(接头)提供一个完整的蛋白质，从而可不必将其连接到载体蛋白上。根据式Ⅰ之多肽的衍生物也包括在本发明的范围内，其中X或Y是或包括“反向一倒置”(“retro-inverso”)氨基酸，即具有相当于氨基酸之功能性基团的双功能胺。例如，根据本发明的，并含有反向一倒置氨基酸的类似物可具有下列结构式 式中R是任何功能基团，例如甘氨酸侧链，A1和A2各较好是由其N或C未端连接的本文限定之一种类似物(但不一定是同样的)的拷贝。也可包括前面讨论过的T细胞抗原决定基。对肽的反转-倒置修饰包括倒转一个或多个肽键，以产生比原始分子对酶促消化有更大抗性的类似物，或者提供一种能产生分支免疫原的方便途径，这样的分支免疫原可含有如中至大免疫原所具有的高浓度抗原决定基。在大批量溶液中使用这些化合物，合成短链生物学活性肽的“反转一倒置”结构类似物，具有很大的潜在价值。应当指出的是，不能使用重组DNA系统直接制备加进了反转一倒置氨基酸衍生物的类似物。但可直接制备基本类似物，然后使用标准肽/有机化学方法对其进行纯化并与反转一倒置氨基酸化学连接。一个实用的、简便的在聚酰胺型树胶上合成反转一倒置肽的固相合成法最近已有所述〔Gazerro，H.，Pinori，M.&amp;Verdini，A.S.(1990).A neugenecal Procedune kor tie Solid-phase synthescs ok retro-inwerso peptide.Ia“Jnnovation and perspectwesin solid phase Synthesis”Ed Roger Epton.SPCC(UK)Ltd.，Birmingham，uk〕。可以通过多肽本身的化学基团，或通过加到其C或N未端上的附加氨基酸，使多肽连接到载体分子上，为使其免疫学功能最佳化，可以与多肽本身分开或者由一个或多个附加氨基酸所包绕。许多键合都是适用的，如包括使用Tyr、Cys和Lys残基的侧链。适用的载体如包括纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)、破伤风类毒素、霍乱毒素B及其亚单位、卵白蛋白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制物、胞壁酰二肽和其类似物，以及Braun氏脂蛋白，以及其他一些本领域技术人员已知的适用载体。当使用PPD作为本发明之多肽的载体时，如果多肽-PPD结合物的接受者体已在以前因例如接受过BCG免疫接种而对结核菌素敏感，便可产生更高浓度的抗体。就人疫苗来说，值得提到的是，在英国和许多其他国家的人口都定期接种BCG，因此都对PPD有很大敏感性。那么在这些国家就可以优选PPD作为载体。多肽与载体偶联的方式将取决于被偶联材料的性质。例如，可用N-γ-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰亚胺使载体中的赖氨酸残基偶联到多肽中C未端或其他半胱氨酸残基上(Kitagawa，T.&amp;Ackawa，T.(1976)，J.Biochem.，79，233)。现有技术文献中已描述了其他一些偶联反应和试剂。可经任何给药途径(如胃肠道外、鼻内、口服、直肠、子宫内)使用或不使用常规佐剂(如氢氧化铝或弗氏完全或不完全佐剂)及/或其他免疫增效剂给予单独的多肽或已连接到载体分子上的多肽。本发明还包括缓释形式的本发明的多肽配方，如包含脂质体(Allison A.C.&amp;Gregoriadis，G.(1974)Nature(London)252，252)或由乳酸与羟基乙酸之共聚物制成的生物可降解微胶囊、(Gresser，J.D.and Sanderson，J.E.(1984)，“Biopolymer Controlled Release Systems”，PP127-138，Ed.D.L.Wise)的皮下植入剂或贮存剂。可以用任何一种常规方法合成本发明的多肽，如直接使用人工合成方法或上面提到的自动肽合成技术，或者间接地使用RNA或DNA合成方法及分子生物学及遗传工程的常规技术。可用这些技术产生含有已插入到其他多肽序列中之一种或多种多肽的杂合蛋白质。因此本发明的另一个方面是提供至少编码本发明之一种合成多肽的DNA分子，且该DNA分子最好是掺入到可在微生物或哺乳动物细胞内复制的适当表达载体中。该DNA可以是编码较长产物之DNA序列的一部分，如这些多肽可以作为其他蛋白质(在这些蛋白质编码DNA中已借助基因工程技术插入了目的多肽的DNA编码序列)的一部分得以表达。作为上述技术的实践指南，可参见“Molecular cloninga Laboratory manual”，by Sambrook，J.，Fritsch，E.F、and Maniatis，T.(2nd Editon，1989)。本发明的多肽可以单独或结合到适当载体上使用，用作(a)预防一个或多个HN病毒株感染的肽疫苗;(b)作为例如HIV阳性患者的血清检验中的配体;(c)作为测试例如抗该多肽的抗体的结合水平的质量控制剂;(d)通过接种适当动物以产生单克隆或多克隆抗体的抗原剂，所产生的抗体适用于(ⅰ)对HIV病毒进行科学研究，(ⅱ)作为诊断试剂，如作为组织化学剂的一部分，(ⅲ)对HIV感染的病人作被动免疫，单独使用或与其他药剂如AZT和/或HIV蛋白酶抑制剂合用以治疗爱滋病，以及(ⅳ)作为一种工具，可作其他药剂(如AZT或HIV蛋白酶抑制剂)击中其表示上可表达HIV衣壳蛋白的HIV感染的细胞，其中这些药剂可以是被共价结合的或以其他方式结合的，如作为含有这些药剂并掺入抗任何抗原性多肽之抗体的脂质体。本发明进一步提供了基因工程化形式的抗多肽抗体或其亚部分，特别是VH区域，并提供使用文献中所述技术制得的最初是在动物体内诱导产生之“人源化”形式的抗多肽抗体;(e)通过在体内解离HIV病毒与人或动物细胞的结合或破坏病毒的三维组织来治疗HIV感染;以及帮助对HIV病毒的体外科学研究。对于HIV或HIV抗体的检测和诊断，本领域熟练技术人员均知道各种免疫检测法，如夹层检测法，竞争性或非竞争性检测法以及直接或间接标记法。本发明的再一个方面提供了一种检测HIV或HIV抗体的药盒，它包括本发明的至少一种合成多肽。可用常规手段制备能与本发明的合成多肽特异性结合的多克隆或单克隆抗体、这些抗体的拟人源化形式(如参见Thompson，K.M.et al.，(1986)Immunology 58，157-160)、单一结构区域抗体(如参见Ward，E.S.，Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P.and Winter，G.(1989)Nature 341，544-546)、以及可跨越血脑屏障的抗体，且这些抗体均构成本发明的一部分。本发明的抗体自身可用于诊断哺乳动物HIV感染的方法中，其包括将哺乳动物的组织或体液样品与有效量的上述抗体一起保温，并确定所说样品与所说抗体间是否发生交叉反应，并根据需要测定交叉反应的程度和/或速率。至少含有一种所说抗体的诊断药盒也构成本发明的一部分。本发明的再一个方面是提供可用于治疗或预防哺乳动物HIV感染，和/或刺激哺乳动物免疫系统和/或封闭HIV病毒的细胞受体的合成多肽，以及适于这些应用的医药制剂。还包括有关的医药组合物，所说的组合物含有至少一种作为活性成分的上述多肽或多肽一载体结合物，并可配有一种或多种医药上可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。该组合物可以配制成适于口服、经鼻腔、直肠或非胃肠道给药(包括中枢神经系统内给药)的剂型。本发明进一步提供了治疗或预防哺乳动物HIV感染和/或刺激哺乳动物免疫系统和/或封闭HIV病毒之细胞受体的方法，其包括给予有效量的上文中限定的多肽。该多肽可单独使用或与其他爱滋病治疗剂如AZT和/或HIV蛋白酶的抑制剂联合使用。下列实施例旨在进一步阐述而不是以任何方式限制本发明。实施例1使用标准固相F-moc方法合成C未端扩展形式的有下列序列的碱性肽(a)Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys并在两个Cys残基之间形成分子内二硫桥键。在三氟乙酸存在下由树脂上裂解得到肽，然后用凝胶过滤法、离子交换层析法和反相高效液相层析法纯化肽。所得肽的纯度在85%以上。C末端带有丙氨酸酸，以促使连接。将该肽溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS，5mg/ml)中并与等体积卵白蛋白(5mg/ml)混合，然后加入戊二醛至终浓度为0.1%(W/V)。将连接混合物放置30分钟，然后加弗氏佐剂乳化。用在弗氏完全佐剂(FCA)中乳化的250ug肽免疫各组动物(5只动物/组)，其后(14天)用在弗氏不完全佐剂(FIA)中乳化的相似量肽攻击动物。3-4周后，再次用在FIA中乳化的肽攻击动物。攻击后17-10天收集血液样品，并检测对HIV衣壳蛋白的结合。利用已构建的可在被感染细胞之表面上表达HIV衣壳蛋白的重组牛痘病毒(如参见Macket，M.and Smith，G.L.(1986)J.gen.Virol.67，2067，por general ncethodolgy)检测可识别HIV衣壳蛋白的抗合成肽抗体。之所以优选这一检测方法，是因为可检测与病毒感染之细胞表面上的抗原的结合，这样便可比检测与溶液相抗原(例如因为衣壳蛋白上的某些潜在抗原决定基可在体内通过与膜磷脂的相互作用而被掩蔽)的结合更有代表性。用重组牛痘病毒感染在96孔微量浓定板中以单层生长的CVI猴肾细胞。该病毒构建体含有编码HIV衣壳糖蛋白的基因，而且知道已被加工并可在被感染细胞的表面上得以表达。用重复的样品检测羊的抗血清。将50μl不同稀释度的抗血清加到小孔内并保温4小时，然后洗两次并加入第二抗体，即过氧化物酶标记的抗羊血清。在微量板测读器中读出光密度，以确定阳性孔。结果发现该抗肽抗血清与被感染细胞之表面上表达的HIV衣壳蛋白有高亲合性交叉反应(见表1和1A)。这些结果证明这些抗肽抗体可作为有价值的研究工具和诊断试剂。表1用肽(a)的连接物免疫之羊的血清与猴肾细胞表面上表达之重组HIV衣壳蛋白的交叉反应交叉反应< <p>表1A与猴肾细胞表面上表达的重组HIV衣壳蛋白反应时，用肽(a)之连接物免疫之羊的阳性抗血清的典型浓度 上表表明，即使在对试验绵羊血清进行显著稀释的情况下(相对于对照组)，滴度仍大大提高。实施例2中和抗体的一个作用是阻止病毒由被感染细胞向未感染细胞传递。阻止病毒由T细胞向巨噬细胞传递或降低传递比率是很关键的，因为这样可以明显地延长爱滋病病人的寿命。检测了抗肽抗血清于体外抑制合胞体形成的能力。合胞体(syncitia)是因HIV感染的细胞之间形成“桥”而产生的多核巨型细胞。合成含下示序并并在两个Cys残基间有分子内二硫桥键的C未端伸展形式的碱性肽(a)Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys纯化并连接后，用以按实施例1所述方法免疫各组羊。将该抗肽抗血清用于体外HIV中和试验。将抗肽抗体引入用强毒力HIV病毒株感染的人T淋巴细胞和未感染之人巨噬细胞的体外培养物中。发现抗肽抗血清能够抑制该接能了强毒力HIVI病毒株的T细胞与巨噬细胞之混合细胞群体中合胞体的形成，即它们可抑制HIV感染由T细胞向巨噬细胞的播散。发现该抗体可阻止HIV感染巨噬细胞，因此在该体外检测试验中其为中和抗体，而在对照培养物中巨噬细胞显示出已受到感染。结果如表2所示。表2 在HIV感染的人T淋巴细胞和未感染之人巨噬细胞的体外培养物中对强毒力HIV病毒的中和作用“ ”表示高度感染;“-”表示有效地对抗感染细胞培养物 巨噬细胞的感染程度只有HIV感染的T淋巴细胞和未感染的巨噬细胞 HIV感染的T淋巴细胞未感染的巨噬细胞和抗肽(a)抗体 -另外，以合胞体检测法估计了抗肽(a)的阳性抗血清。该试验确定了抗血清阻止活病毒由被感染细胞向未被感染细胞播散的能力，以及阻止通过病毒糖蛋白(gp160)与CD4分子间的反应活性介导的细胞间融合的能力。检测试验是借助检验和计数合胞体而完成的。按下述程序进行合胞体检测试验将供活病毒复制的已知浓度的HIV生产(CD+4)细胞系洗三次，并与特定稀释度的待测抗血清混合。37℃下保温30分钟后，将这些细胞以特定比例与对HIV感染和合胞体诱导作用高度敏感的指示细胞，即CD4+细胞系混合。然后每天观察合胞体形成情况。如表3所示，结果发现抗肽抗体可抑制合胞体形成。表3抗血清对HIV感染的生产细胞和指示细胞系间合胞体形成的抑制作用血清样品 合胞体抑制作用抗肽(a)抗血清 +(3/5动物)正常羊血清 -实施例3得到一批处在获得性免疫缺陷综合症(爱滋病)之不同病性进展阶段，即从无症状到症状全面爆发阶段的HIV感染之病人的血清，以便制得用ELISA程序测出的这些病人的血清与合成肽间反应性的有代表性的图形，从而确定合成肽(HIV之gp120和gp40跨膜蛋白质各区域的结构类似物)与抗HIV-1阳性病人血清中HIV-1表面糖蛋白之抗体间反应性的程度。一百份HIV阳性病人的抗血清均与合成肽(a)起反应。如表4所示，其中有两份血清(得自无症状病人)含有HIV中和抗体，并与肽(a)有交叉反应。表4肽(a)与两份无症状病人的阳性抗血清的交叉反应性权利要求1.一种制造具有至少一株人免疫缺陷病毒(HIV)的衣壳蛋白的至少一种抗原性质的合成多肽的方法，该多肽基本上由式(I)所示的氨基酸序列组成X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Trp-Cly-Cys-R8-R9-R10-R11-R12Cys-Y (Ⅰ)其中R1为Asp或Glu；R2为选自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asn及Gln的氨基酸残基；R3为选自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Lys、HiS、Gln或Arg的氨基酸残基；R4、R5和R11各自代表任何氨基酸残基；R6和R8各自为选自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、或Asn的氨基酸残基；R7为选自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、CyS、Met或Pro的氨基酸残基；R9和R12各自为选自Cly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸残基；R10为选自Lys、His或Arg的氨基酸残基；X和Y各自存在不存在，或各自为一个或多个附加的氨基酸残基；该方法包括使用本身已知的化学、生物学或重组技术偶联残基以及分离多肽。2.如权利要求1所述的方法，其中R2选自Gln或Thr，R3选自Ser、Asn、Gln、Arg或Ala，R4选自Leu、Ile、Gln或Arg，R5为Leu或Iys，R6为Gly或Asn，R7选自Gly、Ala、Leu、Ile、ValMet、Cys、Phe、Tyr、Trp或Ser，R8为Ser或Ala，R9为Gly或Phe，R10为Arg或Lys，R11选自Leu、His、Ile、Gln，且R12选自Ala、Ile或Val。3.如权利要求2所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅱ)的氨基酸序列组成X-Asp-Gln-R3-Leu-R5-Gly-R7-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y (Ⅱ)其中R3、R5、R11、R12的定义同权利要求2，R7为选自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸;X和Y各自存在或不存在，或各自为一个或多个附加氨基酸残基。4.如权利要求3所述的方法，其中R3选自Ser、Asn、Gln和Arg，R11选自Leu、His或Ile，R12为Ile或Ala。5.如权利要求4所述的方法，其中R7选自Ile、Phe、Met、Val或Leu。6.如权利要求5所述的方法，其中R3为Ser或Asn，R5为Lys。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多肽由以下序列组成X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y各自可存在或不存在，或各自为一个或多个附加氨基酸残基。8.如权利要求3所述的方法，其中R3选自Gln或Arg，R5为Leu，R7选自Ile、Phe和Met，R11选自Leu、His或Ile，R12为Ala。9.如权利要求8所述的方法，其中多肽由以下序列组成X-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y各自可存在或不存在，或各自为一个或多个附加氨基酸残基。10.如权利要求2所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅲ)所示的氨基酸序列组成X-R1-R2-R3-R4-R5-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲ)其中R1为Glu或Asp;R2为Thr或Gln;R3为选自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸;R4为选自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸;R5为Lys或Leu;X和Y各自可存在或不存在，或各自为一个或多个附加氨基酸残基。11.如权利要求2或权利要求10所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅲa)的氨基酸序列组成X-Glu-Thr-R3-R4-Lys-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲa)其中R3为选自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸残基;R4为选自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸残基;其中X和Y各自可存在或不存在，或各自为一个或多个附加氨基酸残基。12.如权利要求11所述的方法，其中当R4为Ile时R3为Ser，当R4为Arg或Gln时R3为Ala。13.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多肽链上10位和16位的Cys残基通过分子内二硫桥键相连。14.一种制备通式(Ⅳ)所示合成多肽的方法[La-F]m-[Lb-G]n-Lc (Ⅳ)其中F和G各自可为式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽，L为连接序列，每一连接序列C可相同或不同，a、b和c各自为0或1，m和n各自为正数，该方法包括使用本身已知的化学、生物学或重组技术偶联残基，以及分离多肽。15.一种制备通式(Ⅴ)所示合成多肽的方法其中F为式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽，G为式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽或其它序列，m和n各自为正数，d和e各自为0或1，该方法包括使用本身已知的化学、生物学或重组技术偶联残基并分离多肽Ld-[G-L]m-F-[L-G]n-Le (Ⅴ)16.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多肽包括反相一倒置氨基酸。17.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中多肽包括权利要求1-6中任一项之多肽的抗原有效亚片段或其变异物。18.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多肽另外还包括至少一种F细胞抗原决定基。19.如权利要求1-6中任一项所述的方法，它另外还包括将多肽与疫苗载体相连接。20.一种制备疫苗的方法，其中如权利要求1-19中任一项所定义的、能够有效促进对至少一株HIV的免疫作用的合成多肽是与一种或多种可作药用的佐剂、载体和/或赋形剂相混合。21.一种用于检测HIV或HIV抗体的药盒，它包括至少一种如权利要求1-18之任一定义的合成多肽。22.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使用了重组DNA技术。23.一种药用组合物的制备方法，它包括将权利要求1-19之任一项所定义至少一种多肽作为活性成分与可作药用的佐剂、载体和/或赋形剂相连。24.将权利要求1-6中任一项所定义的合成多肽用于合成一种药剂，以治疗或预防哺乳动物HIV感染和/或刺激哺乳动物的免疫系统和/或阻断细胞上的HIV病毒受体。25.与权利要求1-13中任一项所定义的合成多肽特异结合的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其中该方法包括用权利要求1-20中任一项所定义的合成多肽免疫哺乳动物，并分离所形成的抗体。26.一种用于检测HIV或HIV抗体的诊断盒，它含有与权利要求1-13中任一项所定义的合成多肽特异结合的至少一种抗体或抗原结合片段。27.一种制备药用组合物的方法，它包括将作为活性成分的、与权利要求1-13中任一项所述的合成多肽特异结合的抗体或其抗原结合片段与一种或多种可作药用的佐剂、载体和/或赋形剂相连。28.如权利要求23或27所述的方法，它包括将AZT和/或HIV蛋白酶抑制剂与合成多肽或抗体或其抗原结合片段相连。29.一种诊断哺乳动物HIV感染的方法，它包括将哺乳动物的组织液或体液样品和与权利要求1-13中任一项所述的合成多肽特异结合的有效量的抗体或其抗原结合片段一起保温，并测定所说样品和所说抗体之间是否发生交叉反应，并根据需要测定交叉反应的程度和/或速率。30.一种检测HIV或HIV抗体或其抗原结合片段的方法，它包括将样品与权利要求1-19中任一项所述的至少一种多肽一起保温。全文摘要本发明所公开的合成多肽具有至少一株人免疫缺陷病毒(HIV)的至一种抗原性质，优选的序列为X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中x和Y各自可不存在或各自为一个或多个附加氨基酸残基，且10和16位的Cys残基可通过分子内二硫桥键相连。该多肽可用于诊断、治疗和预防HIV感染。还涉及与该肽特异结合的抗体及其结合片段。文档编号C07K16/00GK1054772SQ91101549公开日1991年9月25日 申请日期1991年3月15日 优先权日1990年3月15日发明者罗伯特·V·非什利夫, 贝利·罗伯逊 申请人:普罗托斯分子设计有限公司