高效离子交换膜色谱纯化卵黄蛋白原技术的制作方法

专利名称：高效离子交换膜色谱纯化卵黄蛋白原技术的制作方法技术领域：本发明属于制备具有生物活性物质的工艺，涉及一种利用高效阴离子交换膜色谱方法从卵生动物的血液、或全身匀浆液中提取、纯化卵黄蛋白原的技术。本技术可在离子交换膜上实现蛋白质的快速浓缩与纯化，产品纯度高，回收率高。本发明可大大节省时间和溶剂用量，并且仪器设备简单，成本低廉。 本技术领域的背景和发展现状大致如下卵黄蛋白原是一种由雌激素诱导生成的高磷糖蛋白，是卵生动物卵黄蛋白的主要前体。正常情况下，雄性动物体内没有卵黄蛋白原，但是在雌激素或类雌激素的诱导下，雄性动物的肝脏也可合成卵黄蛋白原。所以，卵黄蛋白原被认为是一种理想的雌激素和类雌激素生物标志物，近年来被广泛用于环境内分泌干扰物的筛选及环境毒理、污染调查等研究之中。为适应对卵黄蛋白原进行快速和灵敏检测的要求，目前，已有多家公司已经或正在开发卵黄蛋白原的免疫检测试剂盒。在卵黄蛋白原免疫检测试剂盒的开发中，需要大量的纯化的卵黄蛋白原以免疫动物制备抗体，并且作为样品检测时的标准参比。传统的卵黄蛋白原纯化方法主要有离子交换柱色谱法、凝胶过滤色谱法、超速离心法、选择性沉淀法等，这些方法一般需要比较长的分离时间(约60-600分钟)，并且溶液用量比较大(一般色谱方法需要数百毫升溶液)。目前，类似本发明的卵黄蛋白原纯化方法尚未见报道。有关这方面的文献可参见1.H.S.Wiley，L.Opresko，R.A.Wallace，Anal.Biochem.，97(1979)145-152. 2.L.G.Parks，A.O.Cheek，N.D.Denslow，S.A.Heppell，J.A.McLachlan，G.A. LeBlanc，C.V.Sullivan，Comp.Biochem.Physiol.C，123(1999)113-125. 3.M.R.Redshaw，B.K.Follet，Biochem.J.，124(1971)759-766. 4.F.Brion，F.Rogerieux，P.Noury，B.Migeon，P.Flammarion，E.Thybaud，J.M.Porcher，J.Chromatogr.B.，737(2000)3-12. 本发明的目的是提供一种可从卵生动物的血液、或全身匀浆液中快速分离纯化卵黄蛋白原的技术，其纯度和回收率完全符合蛋白纯化的要求。完成本发明的技术方案是通过下述方式实现的。首先，选取健康的实验动物，以1-5μg/g的剂量腹腔注射17β-雌二醇，实验室饲养14-21天后，静脉取血，对个体非常小的动物直接进行全身匀浆。动物血液在4℃，3000转/分钟下离心20分钟后，取血清，按1∶5-10的比例用样品缓冲液(pH＝6.5-8.5的磷酸盐或Tris-盐酸缓冲液，浓度为0.02mol/L，含NaCl 0.07mol/L)稀释，过0.45微米滤膜备用；动物匀浆液转移入离心管中，在4℃，10000转/分钟下离心30分钟，小心去除上层脂肪，将清液用0.45微米滤膜过滤，备用。纯化时，用10毫升样品缓冲液以10毫升/分钟的流速通过高效阴离子交换膜，使之预平衡，然后以10毫升/分钟的流速使样品溶液通过高效阴离子交换膜，并用10毫升样品缓冲液冲洗，以除去未结合的蛋白。接下来，分别用5毫升洗脱缓冲液A和B(pH＝6.5-8.5的磷酸盐或Tris-盐酸缓冲液，浓度为0.02mol/L，含NaCl分别为0.27mol/L和0.42mol/L)依次冲洗阴离子交换膜，收集洗脱缓冲液B所对应的洗脱组份，此组份即为纯化的卵黄蛋白原。最后，用10毫升恢复缓冲液(pH＝6.5-8.5的磷酸盐或Tris-盐酸缓冲液，浓度为0.02mol/L，含NaCl 1mol/L)冲洗高效阴离子交换膜，即可用于下一次分离。在完成本发明的过程中，我们从不同种类的卵生动物鲤鱼、鲫鱼、鳙鱼、泥鳅和鸡的血清以及斑马鱼的全身匀浆液中成功的提取纯化了相应的卵黄蛋白原，并用高效凝胶过滤色谱和聚丙烯酰胺凝胶变性电泳对所纯化的蛋白进行了鉴定，结果证明蛋白具有很高的纯度，其分子量为440-500KD，与文献报道一致。另外，我们还与文献中经常采用的阴离子交换柱色谱方法进行了比较，如下表所示，结果证明本发明可大大节省时间和溶剂用量，并且操作简单。表1、本发明与传统阴离子交换柱色谱方法分离卵黄蛋白原的比较参数 本发明 阴离子交换柱色谱功能基团 二乙基乙二胺或季胺盐二乙基乙二胺分离时间 5分钟 600分钟溶液用量 40毫升 500毫升工作温度 室温4℃权利要求1.一种从卵生动物的血液或全身匀浆液中提取、纯化卵黄蛋白原的技术，其特征是血液或全身匀浆液经样品缓冲液稀释和过滤后直接通过高效阴离子交换膜，再用含更高浓度氯化钠的洗脱溶液洗脱，可以获得纯度大于95％的卵黄蛋白原。2.按照权利要求书1所述的提取、纯化卵黄蛋白原技术，其特征是洗脱时采用阶梯式洗脱方法，所用洗脱溶液中氯化钠的浓度分别为0.27mol/L和0.42mol/L。3.按照权利要求书1所述的提取、纯化卵黄蛋白原技术，其特征是所用高效阴离子交换膜的功能基团为二乙基乙二胺或季胺盐。全文摘要本发明属于制备具有生物活性物质的工艺，涉及一种利用高效阴离子交换膜色谱方法从卵生动物的血液、或全身匀浆液中提取、纯化卵黄蛋白原的技术。本技术可在离子交换膜上实现蛋白质的快速浓缩与纯化，产品纯度高，回收率高。本发明可大大节省时间和溶剂用量，并且仪器设备简单，成本低廉。文档编号C07K1/16GK1439649SQ03109189公开日2003年9月3日 申请日期2003年4月7日 优先权日2003年4月7日发明者江桂斌, 时国庆 申请人:中国科学院生态环境研究中心