三型羊毛硫肽rochsinA异源表达实现方法

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法。

背景技术：

1、现有技术对于将class iii lanthipeptide合成基因簇转移到大肠杆菌中表达时，由于异源宿主环境中的不稳定性，大肠杆菌内源性的蛋白酶会非特异性地降解这些产物，从而使得获取目标化合物变得困难。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术程序复杂，需要的质粒种类较多的不足，提出一种三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，通过三型羊毛硫肽共表达体系建立、体外酶切、纯化制备、结构鉴定及突变体获取于一体的综合性方法流程，能够在尽可能短的时间内实现三型羊毛硫肽的优化表达制备。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明涉及一种三型羊毛硫肽化合物rochsin a，其核心肽分子结构式为：

4、

5、本发明涉及上述三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，通过大肠杆菌bl21(de3)共表达class iii lanthipeptide合成基因簇rcs核心基因，经发酵制备和分离纯化得到三型羊毛硫肽rochsin a。

6、所述的class iii lanthipeptide合成基因簇rcs核心基因，通过以下方式得到：第一阶段通过重叠(overlap)pcr扩增precursor基因序列(precursor基因原始序列如seqid no.1所示)，并将sumo-tag连接至precursor的n端；第二阶段通过降落(touchdown)pcr在原始菌株基因组上扩增出lanthipeptide synthase基因片段(lanthipeptide synthase基因原始序列如seq id no.3所示)。

7、所述的共表达是指：将具有sumo-tag的precursor基因序列和lanthipeptidesynthase基因片段共同导入质粒pcdfduet1中并转移到大肠杆菌bl21(de3)。

8、所述的overlap pcr扩增是指：通过设计得到4条带有同源序列的引物p1-4，其中p1与p2、p2与p3、以及p3与p4都有相互间的同源序列，通过两轮pcr扩增后，胶回收纯化目标片段。

9、所述的touchdown pcr扩增是指：通过在pcr程序的退火阶段逐步降低退火温度优化扩增效率，同时在体系中加入1-2％的dmso(二甲基亚砜)降低gc含量较高dna片段的溶解温度，从而提高这些难扩增片段的扩增成功率。

10、所述的发酵制备是指：先将测序验证的转化子接入lb培养基，37℃过夜培养后，以1％的接种量接入新的lb发酵培养基中，37℃继续培养至对数生长期后，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，将温度调至18℃诱导表达22-24h，以优化蛋白的表达和折叠，之后离心操作收集菌体。

11、所述的分离纯化是指：收集菌体并进行ni-nta亲和层析后通过蛋白质纯化及酶切和两次梯度洗脱后得到，具体包括：

12、步骤1)菌体收集与处理：发酵结束后，离心收集菌体，并用生理盐水洗涤1-2次后，加入lysis buffer，并在冰浴中进行超声破碎处理。

13、步骤2)ni-nta亲和层析：

14、2.1破碎后进行离心，将离心后的上清装入预先用lysis buffer平衡过的ni-nta吸附柱中。

15、2.2在4℃摇床上振荡孵育过夜，孵育期间柱子横置。

16、2.3孵育结束后，首先用5倍柱体积lysis buffer冲洗柱子。

17、2.4用wash buffer洗涤，最后用含高浓度咪唑的elution buffer洗脱并收集洗脱液。

18、步骤3)蛋白质纯化及酶切:

19、3.1使用sds-page蛋白电泳确定目标蛋白所在的组分。

20、3.2对该组分进行超滤浓缩，并将buffer置换为ppase蛋白酶反应的buffer体系。

21、3.3置换完成后，根据nanodrop测得的蛋白浓度，按1：10的摩尔比加入ppase蛋白酶。

22、3.4在4℃下进行16小时的酶切处理，随后加入等体积乙腈并进行冻融操作。

23、3.5离心后，收集上清进行下一步处理。

24、4)两次梯度洗脱：

25、4.1制备中流动相a为10mm nh4hco3的ddh2o，b相为10mm nh4hco3的80％乙腈。

26、4.2梯度洗脱条件如下：0-5分钟，90％a相；5-28分钟，90％-10％a相；28-31分钟，10％a相；31-33分钟，10％-90％a相；33-35分钟，90％a相。

27、4.3使用maldi-tof检测目标化合物所在组分，旋蒸去除溶液后，得到rochsin a。

28、4.4用50mm nh4hco3的ddh2o溶解rochsin a，加入gluc蛋白酶并在37℃反应12小时。

29、4.5加入等体积乙腈进行冻融操作后离心，收集上清进行第二次制备。

30、4.6第二次制备的流动相a为0.1％tfa的ddh2o，b相为0.1％tfa的乙腈，梯度条件与前述相同。

31、4.7通过maldi-tof检测目标化合物所在组分，冻干后即得到rochsin a核心肽。

32、本发明涉及上述方法制备得到的三型羊毛硫肽化合物rochsin a，具有如seq idno.2所示的骨架氨基酸序列。

33、其经过脱水步骤后发生michael加成反应形成两个紧靠的、含有c-c键连接的labionin结构。其中，第5位和第8位的丝氨酸脱水与第11位的半胱氨酸发生加成反应形成labionin环，第12位和第15位的丝氨酸脱水与第19位的半胱氨酸发生加成反应形成labionin环。

34、本发明涉及一种基于上述三型羊毛硫肽rochsin a的应用，通过二级质谱和化学衍生实验，实现对rochsin a结构的快速鉴定。

技术特征：

1.一种三型羊毛硫肽化合物rochsin a，其特征在于，核心肽分子结构式为：

2.一种根据权利要求1所述三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征在于，通过大肠杆菌bl21(de3)共表达class iii lanthipeptide合成基因簇rcs核心基因，经发酵制备和分离纯化得到三型羊毛硫肽rochsina；

3.根据权利要求2所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的共表达是指：将具有sumo-tag的precursor基因序列和lanthipeptide synthase基因片段共同导入质粒pcdfduet1中并转移到大肠杆菌bl21(de3)。

4.根据权利要求2所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的overlap pcr扩增是指：通过设计得到4条带有同源序列的引物p1-4，其中p1与p2、p2与p3、以及p3与p4都有相互间的同源序列，通过两轮pcr扩增后，胶回收纯化目标片段。

5.根据权利要求2所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的touchdown pcr扩增是指：通过在pcr程序的退火阶段逐步降低退火温度优化扩增效率，同时在体系中加入1-2％的dmso(二甲基亚砜)降低gc含量较高dna片段的溶解温度，从而提高这些难扩增片段的扩增成功率。

6.根据权利要求2所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的发酵制备是指：先将测序验证的转化子接入lb培养基，37℃过夜培养后，以1％的接种量接入新的lb发酵培养基中，37℃继续培养至对数生长期后，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，将温度调至18℃诱导表达22-24h，以优化蛋白的表达和折叠，之后离心操作收集菌体。

7.根据权利要求2所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的分离纯化是指：收集菌体并进行ni-nta亲和层析后通过蛋白质纯化及酶切和两次梯度洗脱后得到。

8.根据权利要求2或7所述的三型羊毛硫肽rochsin a异源表达实现方法，其特征是，所述的分离纯化具体包括：

9.一种基于权利要求2-8中任一所述权利要求制备得到的三型羊毛硫肽rochsin a的应用，其特征在于，通过二级质谱和化学衍生实验，实现对rochsina结构的快速鉴定。

技术总结一种三型羊毛硫肽rochsin A异源表达实现方法，其核心肽分子结构式为：本发明通过三型羊毛硫肽共表达体系建立、体外酶切、纯化制备、结构鉴定及突变体获取于一体的综合性方法流程，能够在尽可能短的时间内实现三型羊毛硫肽的优化表达制备。技术研发人员：李志勇,刘正杰受保护的技术使用者：上海交通大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18