一种负载发光染料的纳米颗粒及化学发光检测试纸条的制备方法与流程

本发明属于化学发光免疫分析领域，特别涉及一种负载发光染料的纳米颗粒及化学发光检测试纸条的制备方法。

背景技术：

1、自20世纪70年代arakawe首次报道采用发光信号进行酶联免疫分析以来，化学发光免疫分析(chemiluminescence immunossay，clia)方法发展迅速。其原理是将化学发光或生物发光与免疫反应相结合，通过抗原抗体反应使得目标物被发光物质结合上，然后借助发光物质自身发光的强度直接进行测定。clia方法操作简便、快捷，已应用于生物学、医学研究等领域，成为免疫分析方法中最有前途的方法之一。

2、但是，目前clia检测微量目标物的灵敏度仍有待提高，并且其检测结果容易被样本基质自身发光信号所干扰，造成检测结果的不可靠性。如何从本质上改进，提高clia的检测灵敏度，并且避免检测信号受到样本基质干扰，是将clia应用于临床检测中面临的最迫切的问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种负载发光染料的纳米颗粒及化学发光检测试纸条的制备方法，将aie分子负载到纳米颗粒中，通过对aie分子的高浓度富集，使得在检测中发光信号大大增强，从而提高检测的灵敏度。

2、本发明提供了一种负载发光染料的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：

3、通过有机溶剂溶胀法将聚集诱导发光aie染料包埋至载体中：将载体溶液和表面活性剂溶液混匀，然后加入aie染料有机溶液，将反应容器置于磁力搅拌器上在室温下持续搅拌；反应结束后，离心除去游离的染料和有机溶剂，清洗，得到负载发光染料的纳米颗粒；其中，载体溶液浓度为10-100mg/ml，表面活性剂溶液浓度为0.5-20mg/ml，aie染料有机溶液浓度为5-50mg/ml。

4、所述载体为介孔硅、聚苯乙烯微球ps或金属-有机框架材料mofs。

5、所述载体为聚苯乙烯微球ps时，ps球的直径不大于试纸条膜上的孔径9/10，更优选地，ps球的直径不大于试纸条膜上的孔径4/5，更优选地，ps球的直径不大于试纸条膜上的孔径2/3。ps球的粒径，优选地不大于500nm且不小于50nm，更优选地不大于400nm且不小于100nm。ps球的粒径变异系数，优选地小于10％，更优选地小于5％。

6、优选的，所述载体溶液浓度为20-80mg/ml。更优选的，所述载体溶液浓度为40-60mg/ml。

7、所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠sds。

8、优选的，所述表面活性剂溶液浓度为1-10mg/ml。更优选的，所述表面活性剂溶液浓度为1-5mg/ml。

9、所述aie染料有机溶液的溶剂为四氢呋喃thf。

10、优选的，所述aie染料有机溶液浓度为10-40mg/ml。更优选的，所述aie染料有机溶液浓度为20-30mg/ml。

11、所述载体溶液和表面活性剂溶液的总体积与aie染料有机溶液的体积比为1:1-10:1。优选的，所述体积比为1:1-6:1。更优选的，所述体积比为2:1-3:1。

12、所述搅拌时间为5-12h。优选的，所述搅拌时间为6-10h。更优选的，所述搅拌时间为6-8h。

13、本发明还提供了一种化学发光检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括样品垫、结合垫、nc膜和吸收垫，将含有一种或两种抗体标记的负载发光染料的纳米颗粒包埋于结合垫上。

14、所述一种抗体标记，选用的抗体为鼠抗afp抗体；所述两种抗体标记，选用的抗体为鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体，并且鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体的比例为1:1～10:1。优选的，鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体的比例为1:1～6:1。更优选的，鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体的比例为1:1～3:1。

15、所述结合垫上只有一种抗体标记，nc膜检测线上固定afp抗体，质控线固定羊抗鼠抗体；所述结合垫上有两种抗体标记，nc膜上检测线上固定抗人afp抗体，质控线固定兔抗羊抗体。

16、所述化学发光检测试纸条滴加样本后的检测时长以反应液流过质控线后为止，优选的反应时间为1min～10min，更优选的反应时间为1min～5min。

17、对于检测结果判定，采用紫外或可见光激发，近红外接收进行是试纸条结果读取。紫外或可见光激发，优选地为可见光激发，更优选地，可见光激发波长介于500nm～700nm，更优选地，可见光激发波长介于600nm～700nm，近红外接收波长优选地介于800nm～1100nm之间，更优选地介于800nm～900nm之间。

18、对于结果判定，优选地，直接通过t线的荧光值进行结果判定；更优选地，采用比度法，通过t线和c线的荧光值的比值进行结果判定。

19、首先，采用聚集诱导发光(aggregation-induced emission，aie)染料作为化学发光物质。其特点是在分散状态下几乎不发光，而在聚集状态或固体薄膜下发光大大增强。为了使发光信号更加明显，将aie分子负载到纳米颗粒中，通过对aie分子的高浓度富集，使得在检测中发光信号大大增强，从而提高检测的灵敏度。纳米粒子负载增强aie荧光信号如图2所示。

20、其次，研究证明生物样品和硝酸纤维素膜(nc膜)在近红外(nir)的自发荧光极低，且随着波长红移对光的散射也逐渐降低，因此nir发射的信号除了能消除有色生物样品引入的吸收干扰外，也能降低生物样品和nc膜引入的自发荧光和对激发光散射。为了直接检测血液基质样本，并且使得检测信号不受基质背景信号地干扰，采用红外光为接收波段，通过避开基质自发荧光和散射荧光，大大降低在检测过程中的背景信号干扰，增强检测结果的可靠性。原理如图3所示。

21、有益效果

22、本发明将aie分子负载到纳米颗粒中，通过对aie分子的高浓度富集，使得在检测中发光信号大大增强，从而提高检测的灵敏度；同时，本发明采用红外光为接收波段，通过避开基质自发荧光和散射荧光，大大降低在检测过程中的背景信号干扰，增强检测结果的可靠性；相对于胶体金试纸条。本发明试纸条检测灵敏度高两个数量级，可达到pg/ml的检测水平，可以大大提高化学发光检测灵敏度。

技术特征：

1.一种负载发光染料的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述载体为介孔硅、聚苯乙烯微球ps或金属-有机框架材料mofs。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠sds。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述aie染料有机溶液的溶剂为四氢呋喃thf。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述载体溶液和表面活性剂溶液的总体积与aie染料有机溶液的体积比为1:1-10:1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述搅拌时间为5-12h。

7.一种化学发光检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括样品垫、结合垫、nc膜和吸收垫，其特征在于：将含有一种或两种抗体标记的如权利要求1所述的负载发光染料的纳米颗粒包埋于结合垫上。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述一种抗体标记，选用的抗体为鼠抗afp抗体；所述两种抗体标记，选用的抗体为鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体，并且鼠抗afp抗体和羊抗兔抗体的比例为1:1～10:1。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述结合垫上只有一种抗体标记，nc膜检测线上固定afp抗体，质控线固定羊抗鼠抗体；所述结合垫上有两种抗体标记，nc膜上检测线上固定抗人afp抗体，质控线固定兔抗羊抗体。

技术总结本发明涉及一种负载发光染料的纳米颗粒及化学发光检测试纸条的制备方法，包括通过有机溶剂溶胀法制备负载发光染料的纳米颗粒，并且进一步制备相应的化学发光检测试纸条。本发明将AIE分子负载到纳米颗粒中，通过对AIE分子的高浓度富集，使得在检测中发光信号大大增强，从而提高检测的灵敏度。技术研发人员：刘东辉受保护的技术使用者：上海丹利生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/11