双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用

本发明涉及纳米材料合成，具体为双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用。

背景技术：

1、溶酶体是真核细胞的消化与免疫细胞器，在行使其功能时，需要合适的ph值与温度维持与消化相关酶的活性。当溶酶体的ph值和温度升高和降低都会对酶活性产生负面影响。虽然目前已经广泛的开展了溶酶体ph值相关研究。但是，由于缺乏对温度高选择性以及准确的温度测量方法，无法准确测定细胞各生理过程中溶酶体温度变化。

2、目前，一种准确测定特定细胞器温度的方法是采用微热电偶，但是两个缺点需要克服，第一，大的入侵效应，热电偶的使用会引起细胞器应急，使所测结构受到影响；第二，所测结果为细胞器的给定区域，而且不能监测动态细胞器。相反，荧光成像由于其非侵害性和高的时空分辨率而成为监测细胞内微环境、生物分子和细胞器动态变化的有力工具。如今已经制造了一系列发光温度计，发射中心包括有机染料、荧光蛋白、量子点和掺杂镧系元素的纳米粒子。然而，目前的荧光温度计尚面临准确性和选择性两个技术挑战。例如，基于荧光强度的荧光温度计很容易受到探针浓度的影响，探针被细胞摄取后存在浓度分布不均的现象，而在测量过程中存在光漂白，很难准确测定细胞器中温度的细微波动。比例荧光探针虽然能够避免探针浓度差异的干扰，但它们具有两个发射峰，覆盖了更宽的光谱范围，无法对不同细胞器的温度变化进行多次标记和研究。更不利的是，大多数温度计的发射中心在没有足够保护的情况下，很容易受到活细胞中高活性生物分子的影响，导致意想不到的测量误差，产生有争议的实验结果。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用，解决了现有技术手段中测量溶酶体温度时，存在的细胞侵入性损伤、不能实时检测、以及浓度影响等问题。本申请提供了一种能够通过荧光寿命成像实时检测溶酶体温度的双层保护量子点探针，其合成方法简单，对细胞毒性小，能够长时程实时成像，同时能够避免分子自身浓度与细胞内生物活性分子的影响。通过荧光寿命成像能够准确、实时观测溶酶体温度变化。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：双重保护荧光寿命探针，通过荧光寿命成像实时检测溶酶体温度，避免了细胞微环境、生物活性分子以及探针浓度引起的测量误差。荧光中心由znx(agin)2(1-x)s2(x＝0.8)量子点构成，通过硫化锌外壳和二氧化硅外壳保护量子点，利用两亲性共嵌段聚合物f127、3-氨基丙基二乙氧基硅烷(aptes)改变探针在溶酶体富集能力。

5、优选的，所述探针粒径分布在50-52nm。

6、优选的，所述探针在300-600nm均有紫外吸收峰，且吸收峰的位置不受温度变化而改变，荧光发射峰位置在650nm处，且荧光强度随温度升高而降低，温度从30℃上升到55℃，荧光强度下降30％。

7、优选的，所述探针荧光寿命随温度上升而降低，温度从30℃上升到55℃，荧光寿命从10.893ns下降到10.053ns，且温度与荧光寿命呈线性关系，线性拟合公式为y＝12.153-0.042x，其中y为温度，x为荧光寿命。

8、优选的，所述硫化锌包裹量子点在未包裹二氧化硅外壳时，添加细胞内生物活性分子(如活性氧)，会淬灭量子点荧光，包裹二氧化硅外壳后添加细胞内生物活性分子(如活性氧)，无法淬灭量子点荧光。

9、优选的，所述探针在1-10mg/ml的不同浓度以及ph＝4-7的范围内探针荧光强度，荧光寿命均不会发生变化。

10、优选的，所述探针在经过30℃和55℃之间循环十次后，荧光强度和荧光寿命不变。

11、本发明还提供了一种纳米量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

12、s1、(agln)xzn2(1-x)(s2cn(c2h5)2)4前体粉末制备：称取0.437g二乙基硫代氨基甲酸钠溶解在50ml纯水中，另取0.086g硝酸银、0.151g硝酸铟水合物和0.075g六水合硝酸锌溶解在50ml纯水中，将两溶液混合搅拌5min，然后抽滤，抽滤时使用甲醇和水作为洗涤液，之后将抽滤得到的固体进行干燥，得到前体粉末(agln)xzn2(1-x)(s2cn(c2h5)2)4；

13、s2、znx(agin)2(1-x)s2/zns(x＝0.8)量子点制备：在氮气保护环境下，称取0.05g前体粉末在180℃下，加热30min，在加入3ml油胺，继续在180℃下搅拌3min，取出液体进行离心，除去大颗粒沉淀，加入甲醇，析出固体真空干燥，将干燥后的固体溶解在3ml含有0.006g醋酸锌和0.013g硫代乙酰胺的油胺中，在氮气保护下，180℃加热搅拌30min，加入甲醇，取固体沉淀干燥，得到znx(agin)2(1-x)s2/zns(x＝0.8)量子点；

14、s3、zais-f127溶液制备：称取0.1g f127和0.003gznx(agin)2(1-x)s2/zns(x＝0.8)量子点粉末，溶解在1.5ml四氢呋喃中，将溶液旋转蒸发至完全干燥，加入1.5ml纯水和50μl乙酸，进行超声，得到zais-f127溶液；

15、s4、zais-sio2纳米探针合成：向1.5ml的zais-f127溶液中，缓慢滴加80μl硅酸四乙酯teos，搅拌2h后，加入40μl的3-氨基丙基二乙氧基硅烷aptes，搅拌过夜，然后装入分子量截止量为20000的透析袋中，透析2天，得到最终纳米量子点探针。

16、本发明还提供了一种纳米量子点探针的应用，所述纳米量子点探针作为活细胞中溶酶体荧光寿命成像试剂，实时监测细胞正常状态以及线粒体自噬过程中溶酶体温度。

17、(三)有益效果

18、本发明提供了双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用。与现有技术相比具备以下有益效果：

19、(1)、该双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用，制备对温度敏感量子点发射中心，通过引入zns与sio2双外壳避免周边环境对量子点的影响，引入两亲性共嵌段聚合物f127改变材料的亲水性，修饰碱性基团(—nh2)使其靶向细胞溶酶体。使其能够通过荧光寿命成像准确、实时观测溶酶体温度变化。

20、(2)、该双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用，解决了现有技术手段中测量溶酶体温度时，存在的细胞侵入性损伤、不能实时检测、以及浓度影响等问题。本申请提供了一种能够通过荧光寿命成像实时检测溶酶体温度的双层保护量子点探针，其合成方法简单，对细胞毒性小，能够长时程实时成像，同时能够避免分子自身浓度与细胞内生物活性分子的影响。通过荧光寿命成像能够准确、实时观测溶酶体温度变化。

技术特征：

1.一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于，通过荧光寿命成像实时检测溶酶体温度，荧光中心由znx(agin)2(1-x)s2(x＝0.8)量子点构成，通过硫化锌外壳和二氧化硅外壳保护量子点，利用两亲性共嵌段聚合物f127、3-氨基丙基二乙氧基硅烷aptes改变探针在溶酶体富集能力。

2.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述探针粒径分布在50-52nm。

3.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述探针在300-600nm均有紫外吸收峰，且吸收峰的位置不受温度变化而改变，荧光发射峰位置在650nm处，且荧光强度随温度升高而降低，温度从30℃上升到55℃，荧光强度下降30％。

4.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述探针荧光寿命随温度上升而降低，温度从30℃上升到55℃，荧光寿命从10.893ns下降到10.053ns，且温度与荧光寿命呈线性关系，线性拟合公式为y＝12.153-0.042x，其中y为温度，x为荧光寿命。

5.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述硫化锌包裹量子点在未包裹二氧化硅外壳时，添加细胞内生物活性分子，会淬灭量子点荧光，包裹二氧化硅外壳后添加细胞内生物活性分子，无法淬灭量子点荧光。

6.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述探针在1-10mg/ml的不同浓度以及ph＝4-7的范围内探针荧光强度，荧光寿命均不会发生变化。

7.根据权利要求1所述的一种双重外壳保护量子点的荧光寿命探针，其特征在于：所述探针在经过30℃和55℃之间循环十次后，荧光强度和荧光寿命不变。

8.一种如权利要求1-6中任一项所述的纳米量子点荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.一种如权利要求8中制备的所述纳米量子点探针的应用，其特征在于：所述纳米量子点探针作为活细胞中溶酶体荧光寿命成像试剂，实时监测细胞正常状态以及线粒体自噬过程中溶酶体温度。

技术总结本发明公开了双重保护荧光寿命探针、制备方法及监测溶酶体温度应用，探针用硫化锌和二氧化硅壳将荧光团Zn<subgt;x</subgt;(AgIn)<subgt;2(1‑x)</subgt;S<subgt;2</subgt;(x＝0.8)量子点与周围环境与完全隔离，阻止细胞微环境及生物活性分子与ZnS量子点相互作用，使其荧光寿命仅对环境温度敏感。通过两亲性共嵌段聚合物F127与特定细胞器靶向基团(‑NH<subgt;2</subgt;)修饰使其能够进入细胞并富集在溶酶体中，结合荧光寿命成像避免探针浓度的改变影响精确度，动态地绘制活细胞溶酶体的温度分布图。通过荧光寿命成像显微镜观察到溶酶体中的平均温度与环境温度几乎相同，但在线粒体自噬过程中，溶酶体吞噬线粒体时的温度升高‑6℃。该探针能够精确、实时地跟踪活细胞溶酶体的温度波动，对于深入了解活细胞的代谢和行为具有重要意义。技术研发人员：安国庆,张瑞龙,刘正杰,韩光梅,耿军龙,张忠平受保护的技术使用者：安徽大学技术研发日：技术公布日：2024/6/23