一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法及应用

本发明涉及葡萄糖检测材料，尤其涉及一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法及应用。

背景技术：

1、葡萄糖是生物系统中动植物碳水化合物的主要成分，在生命过程中扮演着重要角色。它不仅是活细胞的能量来源，而且还是合成其他复杂分子的代谢中间体。此外，血液中葡萄糖水平也是评估人类健康状况的指标之一，人体尿液或血液中葡萄糖含量的异常变化是糖尿病或低血糖的诊断指标。血糖浓度因受到神经系统和激素的调节而保持相对稳定，当这些调节失去原有的平衡时，则出现高血糖或低血糖。因此，准确、快速测定血糖含量在临床诊断方面意义重大。此外，葡萄糖的准确测定在食品分析中也非常重要。

2、比色法测定葡萄糖已引起广泛关注，天然酶，尤其是过氧化物酶，在比色法中应用广泛，具有高效的催化能力和优异的选择性。然而，天然酶存在许多缺陷，例如提取成本高、易变质、在恶劣条件下稳定性差等，这些缺点限制了其应用。为了克服这些不足，已经开发了多种具有模拟酶活性的人工合成材料，如金属氧化物、石墨烯、纳米材料和金属有机框架。与天然酶相比，人工模拟酶具有制备简单、易修饰、价格低廉、特异性强和灵敏度高等优势，可以克服天然酶价格昂贵、来源有限、易受环境影响而失活等缺点。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法及应用，其制备得到的铂纳米簇基于类过氧化物酶活性，可用于葡萄糖的比色传感。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法，具体步骤如下：

4、步骤1、称量浓度为20～40mg ml-1的胃蛋白酶固体，加入280μl水溶解，将80μl浓度为10mm的氯铂酸溶液加入到胃蛋白酶溶液中，在室温条件下，快速搅拌5分钟，得到溶液a；

5、步骤2、将浓度为1m的氢氧化钠溶液加入至步骤1得到的溶液a中，调节ph至9～13，混合均匀，得到混合溶液，在25～55℃水浴条件下加热0～10小时，得到溶液b；

6、步骤3、将步骤2得到的溶液b，在磷酸缓冲液中透析24小时，去除未反应的原料，纯化得到铂纳米簇，4℃保存。

7、优选地，在步骤1中，胃蛋白酶的浓度为35mg ml-1。

8、优选地，在步骤2中，调节ph至13，反应温度为50℃，反应时间为8h。

9、本发明还提供了一种采用上述的制备方法得到的具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇在葡萄糖检测中的应用。

10、优选地，采用模拟酶比色法检测，其检测方法包括如下步骤：

11、步骤1、将不同浓度的葡萄糖和葡萄糖氧化酶在37℃恒温孵育20min；

12、步骤2、然后加入50μlpep-ptncs和适量3，3’，5，5’-四甲基联苯胺tmb，置于naac-hac缓冲液中，调节ph为4，定容至500μl，室温下充分混匀放置反应30min；

13、步骤3、用紫外可见分光光度计进行光谱扫描，以652nm处的吸光度(a652)进行定量，实现可视化比色检测葡萄糖。

14、优选地，检测葡萄糖的线性范围为1-10μm，检测限为1.57nm。

15、通过采用上述技术方案：其制备得到的铂纳米簇具有较好的类过氧化物酶活性，通过葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖产生h2o2，基于铂纳米簇(pep-ptncs)优异的类过氧化物酶活性，在h2o2存在的条件下催化氧化tmb变蓝，tmb氨基失去一个电子变为阳离子自由基，并在体系中以二聚电荷转移复合体的形式存在，该二聚体在652nm处有最大吸收，利用该最大吸收与葡萄糖浓度建立定量关系，从而实现对葡萄糖浓度的检测。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、1、本发明以胃蛋白酶为模板，采用一步合成法制备pep-ptncs，制备过程简单，价格低廉。由于其尺寸接近电子的费米波长，ncs具有尺寸可调的电子跃迁，表现出较强的发光性能，具有优异的荧光和化学稳定性，可以克服传统有机染料荧光寿命短，易光漂白等缺点；又具有类过氧化物酶活性，用于催化比色分析。

18、2、本发明基于葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化生成h2o2，tmb与h2o2在pep-ptncs的类过氧化物酶催化下发生反应，tmb氨基失去一个电子变为阳离子自由基，并在体系中以二聚电荷转移复合体形式存在，该二聚体在652nm有最大吸收，呈蓝色。

19、3、本发明所构建的方法测定特异性好、灵敏度高，检测限低至1.57nm。

20、4、本发明所构建的方法无需复杂的样品前处理过程即可用于血清中葡萄糖的测定。

技术特征：

1.一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法，其特征在于，在步骤1中，胃蛋白酶的浓度为35mg ml-1。

3.根据权利要求1所述的一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇的制备方法，其特征在于，在步骤2中，调节ph至13，反应温度为50℃，反应时间为8h。

4.一种采用权利要求1-3任意一项所述的制备方法得到的具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶-铂纳米簇在葡萄糖检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用模拟酶比色法检测，其检测方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测葡萄糖的线性范围为1-10μm，检测限为1.57nm。

技术总结本发明涉及葡萄糖检测材料技术领域，尤其涉及一种具有类过氧化物酶活性的胃蛋白酶‑铂纳米簇的制备方法及应用，包括：以胃蛋白酶为模板，在特定的pH条件下制备胃蛋白酶‑铂纳米簇，在320nm激发波长下，在410nm处有最佳发射。本发明制备得到的铂纳米簇，既具有类过氧化物酶活性，又具有荧光特性，利用其类过氧化物酶活性用于葡萄糖的比色检测。同时，该铂纳米簇可用于对1‑10μM浓度范围内的葡萄糖进行定量检测，检测限低至1.57nM。技术研发人员：付丁伊,余明娣,周梦艳,陈文婷,张智慧,苏曜源受保护的技术使用者：南通大学技术研发日：技术公布日：2024/6/30