生物标志物的检测的制作方法

本发明涉及使用光散射，尤其是干涉散射显微镜法或质量光度计法来检测或定量样品中的生物标志物。具体地，本发明涉及诊断与样品中的生物标志物相关的疾病或病症的方法。还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。由于样品可能是复杂的，在存在其他组分的情况下，生物标志物可能作为次要组分存在。因此，生物标志物可能会以低浓度存在。

背景技术：

1、生物标志物的检测或定量已经被广泛用作诊断疾病或病症或者确定个体对某种疾病病症的易感性的工具。生物标志物检测是个性化医疗发展中的一个非常有价值的工具，能够对那些测试出存在或不存在指示性生物标志物或生物标志物组的患者进行有靶向治疗方案。例如，癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病可以通过检测取自体液(诸如血液、csf和尿液)的样品中蛋白或其他生物标志物的异常存在来诊断。这种生物标志物可以是特定蛋白、蛋白亚型、翻译后修饰的存在与否，异常量的蛋白或者蛋白与蛋白/代谢物或蛋白与其他生物分子(例如糖、多糖、核酸)的相对比例的变化。

2、生物标志物包括广谱的细胞、生物化学和/或分子变化，这些变化可以被评估、监测或测量，并且与健康状况、致病过程或对治疗或医学干预的反应相关联。生物标志物通常用于诊断相对晚期的几种疾病，但是它们在治疗或预防措施可能更有效的早期检测中的潜力仍然非常有限，这主要是因为早期疾病生物标志物不丰富并且以非常低的浓度存在。检测低丰度生物标志物的最常见方法包括靶向质谱法或定量质谱法，以及基于适配体的蛋白质组学。

3、随着合适的生物标志物的鉴定的发展，用于检测或定量生物标志物的方法、系统和硬件得到了开发。最常用的方法是基于酶联免疫吸附测定法(elisa)和聚合酶链式反应(pcr)的测试，它们具有高灵敏度，但要么必须针对快速非定量测试进行优化，要么需要30分钟至几个小时才能完成，因此对于在护理点使用来说过于复杂和/或昂贵。

4、已经开发了其他方法(诸如电化学免疫测定法、表面增强拉曼光谱法、流式细胞法或基于荧光的其他技术)来解决elisa的缺点，但是迄今为止没有一种方法达到简单、可负担的仪器与高特异性和灵敏度的理想组合。

5、近年来，干涉散射显微镜法(interferometric scattering microscopy,iscat)，尤其是质量光度计法(mass photometry)已经发展成为用于单分子检测的强大分析技术，为诸如elisa的测定法提供了简单且成本有效的替代方法。iscat提供了关于溶液中不同质量颗粒的相对分布的信息，而无需添加标签。之前已经描述了iscat用于检测经纯化的单一蛋白(cole et al(acs photonics,2017,4(2),pp 211-216and wo2018/011591)，以及用于检测脂蛋白和确定溶液中分子的浓度(wo2019/110977)。质量光度计法尤其已经记载于young et al,science,apr 2018:vol.360,issue 6387,423-427)和li et al,nucleicacids research,august 2020,https://doi.org/10.1093/nar/gkaa632。

6、干涉散射质谱法(interferometric scattering mass spectrometry,iscams)，在本文中称为质量光度计法(mass photometry,mp)，是用于检测和测量溶液中单种目标及其形成的复合物的质量的方法。随着单种分子非特异性或特异性结合到表面，mp通过光散射来检测该单种分子。每个结合事件引起表面/溶液界面处折射率的变化，这有效地改变了局部光散射，并且可以通过利用散射光和反射光之间的优化干涉来以高精度检测。通过用已知质量的分子进行校准，信号变化的幅度可以转化为分子量，对于多肽，质量精度约为2％且质量分辨率高达20kda。因此，散射信号与分子质量成正比，使得用光称量单种分子成为可能。然而，这种技术不能简单地应用于其中一种分子可能一低丰度存在的复杂溶液。因此，尽管事实上该低丰度的分子可以非特异性地结合到表面并允许质量的检测，但是可能存在太多的混杂成分而不能准确确定质量，从而确定识别该分子。这使得所述分子的识别变得复杂，并且浓度的确定变得困难。因此，该技术在样品中低丰度生物标志物的应用受到了限制。

7、质量光度计法的独特之处在于它精确测量溶液中单种分子在自然状态下的质量而无需标签的能力。

8、光散射长期以来用于生物化学分析，诸如利用与穿过样品的入射光成一定角度的光强度来测量溶液中的光散射物质，称为“浊度法”。存在依赖于光散射原理的其他更精细的方法，诸如动态光散射(dls)(测量颗粒的大小和大小分布)、电泳光散射(els)(测量电泳迁移率和ζ电势)和小角激光光散射(lalls)(能够测量样品中聚合物的分子量分布)。然而，所有这些都不同于本发明中使用的光散射方法和设备，因为所使用的技术能够直接测量表面处的单分子(目标)的质量。值得注意的是，依赖于光散射原理的技术，诸如表面等离子体共振完全取决于多个颗粒的结合以在测定中引起折射率的整体变化，这不能提供确定复杂溶液中生物标志物的存在、浓度和单个质量所需的细节水平。

9、用于疾病进展、疾病消退或潜在候选药物的快速临床筛选的生物标志物的检测中仍然缺乏灵敏性和特异性。举例来说，最常见的生物标志物之一是c-反应蛋白(crp)，但是该生物标志物是非特异性的，并且可以指示各种不同的病症和疾病。对常规可获得的更特定生物标志物的分析进行改进将是常规诊断中的转折点。此外，神经系统疾病和癌症的生物标志物通常存在于疾病早期阶段的体液中，但是它们的浓度可能太低而不能被护理点可用的常规技术准确检测到。为了适合护理点环境，进一步需要在保持准确性的同时，降低获得化验结果所需的成本、时间和技能。

10、因此，仍然需要一种特定且灵敏的方法，该方法能够定量检测包括碎片或大聚集体(例如生物样品)的肮脏环境中非常低丰度的生物标志物，并且该方法还适用于护理点环境。

技术实现思路

1、本发明人已经令人惊讶地确定了一种方法，该方法能够使用光散射来特异性检测生物标志物，尤其在样品中以低丰度存在的那些生物标志物，如本文所限定。本发明人已经表明，能够检测复杂样品中的低丰度生物标志物，而无需冗长的纯化程序。本发明人开发的方法尤其适用于检测生物样品中的生物标志物，例如用于疾病或病症的诊断。它还尤其适用于监测工业和农业样品中的生物标志物，诸如监测例如食品生产系统中的病原体或污水中的病毒疾病的爆发。

2、鉴于干涉光散射显微镜法和实际上的质量光度计法能够简单地通过分子与表面的非特异性结合来确定溶液中该分子的质量和浓度，发明人已经开发了一种反直觉的方法，该方法依赖于通过生物标志物利用捕获剂与表面的特异性结合。然而，本发明人没有测量这种结合(其对于这种确定是常规)，而是确定这种测量没有产生足够准确或定量的结果，尤其是如果样品中存在其他组分且因此低丰度物质将仅代表大量非特异性结合事件背景中非常少的结合事件。因此，他们意识到，通过有效地确定目标在部分或全部释放(作为颗粒)之前和之后在表面处的质量，能够间接测量颗粒的质量—独立于样品中丰富得多的物质的非特异性结合。鉴于准确的检测方法，本发明可用于在生物标志物从捕获剂释放的情况，或者捕获剂或其一部分确实与捕获剂一起释放的情况。这使得在选择捕获剂和实际释放剂时具有灵活性。

3、由于生物标志物可能以低丰度存在，并且还存在样品的其他组分，因此目前不可能经由结合进行常规浓度检测。这是因为其他组分会非特异性地结合到表面上并提供混杂数据。对此的完美解决方案是特异性捕获生物标志物，经由洗涤去除混杂组分，然后通过监测表面光散射的变化或差异来检测生物标志物的释放。该差异可以被赋予质量，然后可以赋予生物标志物的识别。

4、因此，在第一方面，提供了检测样品中生物标志物的方法，所述方法包括：使表面与样品接触，其中所述表面包含固定于其上的针对生物标志物的捕获剂；从该表面释放所有被捕获的生物标志物；以及通过光散射检测所述生物标志物的释放。

5、在干涉光散射显微镜或质量光度计中检测光散射。

6、合适地，提供了用于检测样品中生物标志物的方法，其中该方法包括：

7、i)提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合所述样品中存在的生物标志物；

8、ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与所述样品接触；

9、iii)界定所述表面的第一检测区域；

10、iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：

11、i.从与所述生物标志物结合的所述捕获剂释放的生物标志物；

12、ii.包含与所述捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

13、iii.未结合的捕获剂；

14、v)通过光散射检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒。

15、通过检测表面处光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两个测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。

16、释放事件之前和之后的测量使得能够检测负质量事件。利用本发明的方法，通过记录表面处的变化，能够确定释放的颗粒的质量。这允许直接确定特定生物标志物是否存在。

17、合适地，提供了用于检测样品中生物标志物的方法，其中所述方法包括：

18、i)提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合所述样品中存在的生物标志物；

19、ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与所述样品接触；

20、iii)界定所述表面的第一检测区域，并利用光散射对所述表面进行测量；

21、iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：

22、i.从与其结合的所述捕获剂释放的生物标志物；

23、ii.包含与所述捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

24、iii.未结合的捕获剂；

25、vi)通过确定光散射中的变化检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒。

26、表面的测量可以是表面处对目标的测量。所述表面优选为单一表面。所述表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，所述表面是平坦的玻璃盖玻片。

27、光散射方法可以是干涉散射显微镜法。光散射方法可以是质量光度计法。

28、第一检测区域可以是可观察的表面，或者是释放剂所接触的区域。

29、实际上，本发明从根本上改变了干涉光散射(iscat)的使用方式，实现了测量方式的完全逆转。iscat及类似技术通常应用于基本上纯的或具有极少“杂质”(诸如不感兴趣的其他分子)的样品。为了检测样品中的“稀有”物质，已经尝试了各种技术，诸如阻断表面以防止其他物质结合。即使表面钝化，也可能发生非特异性结合。在此描述的新方法允许检测复杂样品中的稀有物质，因为并不检测非特异性结合事件，这些物种可以被洗掉，然后该方法完全集中于稀有物质特异性的解结合事件。

30、颗粒(包括单一生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂)从表面的释放可以被称为释放事件。合适地，从表面释放颗粒的步骤可以以允许通过光散射检测单个释放事件的速率进行。光散射显微镜法能够确定从表面释放到溶液中的颗粒的质量，通过知晓它们的质量可以确定它们的身份。实际上，在表面处检测质量损失。使用光散射显微镜法来检测从表面释放到溶液中的生物标志物使得能够以高度灵敏的方式特异性检测低丰度生物标志物。该方法具有避免需要对生物标志物或生物标志物/捕获剂复合物进行标签化的优点。此外，该方法允许捕获生物标志物群体的质量异质性，这是任何其他技术都无法获得的信息。

31、优选地，在光散射显微镜法中，任选地在质量光度计法中，表面可以被描述为几乎持续地被询问或检查，诸如经由接近连续的重复率。这通常使用本文描述的表面的受控照明来进行。光散射装置通过表面处的光散射来检测单种分子。因此，本发明可以监测表面并检测表面处的目标(其可以是单独的捕获剂、与生物标志物结合的捕获剂，或者甚至是来自样品的额外组分)。释放事件可以由释放剂的添加引起。每个释放事件引起局部光散射(例如目标的)的变化，从而利用散射光和反射光之间的优化干涉，能够高精度地检测到这种变化。信号的任何变化的幅度都可以转换成分子质量。

32、因此，释放的颗粒的质量被检测到。这种检测是间接的。

33、优选地，因为在释放事件之前和之后进行测量，所以能够检测某个位置的变化或某个位置的目标。简而言之，这意味着要进行两次测量来检测释放事件。因此，释放事件可作为负质量事件被检测到：检测到质量的离去。因此，该测量允许检测表面处的目标，然后随后该颗粒从该目标的释放。通过计算释放事件前后的质量差，能够确定被释放颗粒的身份。图5是检测到的“负质量”的示例。因此，该方法可包括监测一个或更多个特定目标的变化。因此，该方法可以包括监测一个或更多个特定位置的变化。该变化可以是指示颗粒释放的光散射的变化。

34、可以对进行释放事件的速率进行控制，从而能够在负质量事件发生时对其进行监测。

35、信号的任何变化的幅度都被转换成该变化的分子质量。

36、使用本发明的方法可以检测生物标志物的任何修饰，例如糖基化、核酸的附接，或者泛素化。“翻译后”或其他修饰的检测可能是归因于与经修饰的生物标志物相关的特定分子量。

37、第一方面方法的方法可以用于确定样品中生物标志物的浓度。因此，该方法可包括：测量从捕获剂释放的生物标志物的量和/或从生物标志物/捕获剂复合物被固定的表面释放的生物标志物/捕获剂复合物的量。该方法可用于通过与校准曲线比较来确定浓度。为了构建校准图，制备一系列含有已知浓度参考标准的校准溶液。可以使用包括已知数量的释放事件的对照来构建校准曲线。校准曲线可用于获得生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的量或浓度的测量。

38、也可以使用内部标准。作为分析方法的常规，内部标准是以恒定量添加到表面的化学物质，用于进行校准和/或生物标志物检测测定中的一者或两者。然后，通过绘制生物标志物信号与内标信号的比率随生物标志物浓度的变化，内部标准可用于校准。

39、然后，可使释放事件中检测到的对比度(contrast)与第二质量校准曲线相关联，以识别它们的质量。为了构建质量校准图，制备一系列含有已知质量颗粒的校准溶液。在使用质量光度计法的情况下，可以通过质量来识别颗粒，并且可以使用校准曲线来获得单一生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的定量。测量从表面释放的未结合的捕获剂的量可用于定量样品中存在的生物标志物所占据的捕获剂的比例，并提供定量结果。

40、从表面释放生物标志物和/或生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的步骤可以包括破坏生物标志物和捕获剂之间的结合，和/或破坏捕获剂和捕获剂固定于其上的表面之间的结合。合适地，该破坏足以使生物标志物与捕获剂和/或使捕获剂与表面完全分离。如本文所述，可以使用用于介导生物标志物和/或捕获剂释放的任何合适的手段或方法。合适的方法包括改变表面的化学环境、捕获剂的酶消化和/或光解或水解。释放生物标志物的合适方法包括引入竞争性配体，该竞争性配体对促进释放事件的捕获剂具有更高的结合亲和力。

41、该方法可以进一步包括将释放的生物标志物/捕获剂复合物的质量与生物标志物的预期质量进行比较。这种方法对于检测异质生物标志物群体中的生物标志物可能是有用的。

42、第一方面的方法可以进一步包括对表面的第二检测区域或额外的检测区域重复步骤iv)和步骤v)。对于第二检测区域或额外的检测区域，步骤iv)和步骤v)的重复可以在与在表面的第一检测区域或任何先前检测区域上进行的步骤iv)和步骤v)相同或不同的观察事件中进行。合适地，在任何具体观察事件中，生物标志物和/或生物标志物/捕获剂复合物的释放可以被限制到感兴趣的检测区域。

43、在步骤i)之前，本发明的方法可以进一步包括：在表面上捕获样品中存在的生物标志物。这种捕获可以是特异性的，从而用于富集表面上的生物标志物。因此，本发明的方法可以包括：

44、i)提供表面；

45、ii)提供待分析生物标志物的存在和/或量的样品；

46、iii)将特异性结合待检测生物标志物的捕获剂固定在表面上；

47、iv)将iii)的表面与样品在合适的条件下孵育合适的时间，以允许样品中存在的生物标志物与固定在表面上的捕获剂结合。

48、任选地，在步骤(iv)之后，可以洗涤表面以除去未结合的实体，并除去已经非特异性结合到表面或捕获剂的实体。对洗涤条件进行选择，使得捕获剂和生物标志物之间的相互作用不受影响。合适的条件包括加入温和的洗涤剂或低浓度的盐溶液。或者，在添加用于检测步骤的合适溶液之前，可以包括干燥步骤。该干燥步骤可包括在表面上使用诸如氮气的气流。这种洗涤和任选的干燥步骤可以称为步骤(v)。

49、这种步骤(i)至(v)可以在任何光散射设备之外进行。

50、这种步骤(i)至(v)可以在照射表面之前进行。

51、一旦表面已经与样品接触并且进行了诸如(i)至(v)的适当的制备步骤，表面可以(vi)与缓冲液接触以确保表面在溶液中。

52、步骤(i)至(vi)中的任何一个可以在任何检测步骤之前以任何合适的顺序进行。

53、本发明的方法可以进一步包括进行表面的光散射的基线测量。这一步骤可以在上述步骤i)至步骤iv)中的任何一个或更多个之后进行。基线测量可以作为对照测量。基线测量可以通过其光散射提供关于固定在表面上的任何目标的信息。基线测量可用于确定表面的光散射，以允许任何校准。此外，基线测量可以提供随机释放事件的测量，从而提供基线，在该基线之上，预计的释放事件是特异性的并且值得检测。

54、本发明的方法可涉及多重测量步骤，一旦表面出现在光散射设备中，即已经进行了上述所有必要的准备步骤，就可以开始测量步骤。因此，测量可以在上述步骤(iii)之后的任何点开始。这些多重测量可以是离散的(例如以时间间隔)，或者测量可以有效地是连续的(以恒定速率进行测量，以便产生膜-见下文)。多重测量可以允许确定表面上目标的质量，并因此检测从所述目标释放的任何颗粒。因此，这允许检测释放事件。因此，释放事件的检测可以描述为在释放事件之前和之后检测目标的质量，并计算该目标的质量差。因此，监测一个或多个特定目标的质量变化。因此检测目标的信号幅度的变化。

55、本发明的方法可进一步包括使用具有已知数量的释放事件的对照分子生成校准曲线。

56、本发明第一方面的方法可用于检测或定量样品中的生物标志物。

57、第一方面的方法可用于检测生物分子的修饰，例如蛋白的翻译后修饰或核酸的甲基化状态。经修饰的生物分子可以是生物标志物。

58、第一方面的方法可用于检测样品中两种或更多种生物分子之间的相互作用。生物分子之间的复合物可以是生物标志物。

59、第一方面的方法可用于比较样品中两种或更多种生物标志物的量。

60、还提供了检测样品(例如细胞培养物或食物制备样品)中污染的方法，包括第一方面的方法，其中生物标志物的存在指示样品的污染。

61、还提供了定量产物表达水平的方法，其中该方法包括第一方面的方法，并且其中该生物标志物指示表达产物的存在或不存在。

62、还提供了检测或定量样品中生物分子之间相互作用的方法，包括第一方面的方法，其中生物标志物的存在或量指示相互作用的存在或不存在或量。这种方法对于检测影响生物标志物的存在或活性的化合物的存在或量可能是有用的。

63、在第二方面，本发明提供了在受试者中诊断与生物标志物的存在、不存在或量相关的疾病或病症的方法，其中所述方法包括使包含其上固定有生物标志物的捕获剂的表面与样品接触，从表面释放任何捕获的生物标志物，并通过光散射检测生物标志物的释放。该量可以是与另一种生物标志物相比的相对量。

64、合适地，在受试者中诊断与生物标志物的存在或量相关的疾病或病症的方法包括：

65、i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；

66、ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；

67、iii)界定表面的第一检测区域；

68、iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：

69、i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；

70、ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

71、iii.未结合的捕获剂；

72、v)通过光散射检测从表面的第一检测区域释放的颗粒，

73、其中i)或ii)的存在与否指示受试者中疾病或病症的存在、严重性或发展可能性。

74、通过检测表面光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两次测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。

75、合适地，在受试者中诊断与生物标志物的存在或量相关的疾病或病症的方法包括：

76、i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；

77、ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；

78、iii)界定表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；

79、iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：

80、i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；

81、ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

82、iii.未结合的捕获剂；

83、vi)通过确定光散射的变化来检测从表面的第一检测区域释放的颗粒，

84、其中i)或ii)的存在与否指示受试者中疾病或病症的存在、严重性或发展可能性。

85、表面的测量可以是表面处目标的测量。该表面优选为单一表面。该表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，表面是平坦的玻璃盖玻片。

86、合适地，确定与样品中生物标志物的存在或量相关的污染物的存在/不存在的方法包括：

87、i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；

88、ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；

89、iii)界定表面的第一检测区域；

90、iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：

91、i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；

92、ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

93、iii.未结合的捕获剂；

94、v)通过光散射检测从表面的第一检测区域释放的颗粒；

95、其中i)或ii)的存在与否指示污染的存在、严重性或性质。

96、通过检测表面光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两次测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。

97、合适地，确定与样品中生物标志物的存在或量相关的污染物的存在/不存在的方法包括：

98、i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；

99、ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；

100、iii)界定表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；

101、iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：

102、i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；

103、ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或

104、iii.未结合的捕获剂；

105、v)通过确定光散射中的变化检测从表面的第一检测区域释放的颗粒；

106、其中i)或ii)的存在与否指示污染物的存在、严重性或性质。

107、表面的测量可以是表面处目标的测量。该表面优选为单一表面。该表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，表面是平坦的玻璃盖玻片。

108、这些方法中的任一种或任何一种中的光散射方法可以是干涉散射显微镜法或质量光度计法。

109、在表面与样品接触后，可包括洗涤表面的任选步骤。本文描述了合适的洗涤条件。

110、在检测步骤之前，在表面与溶液接触之前，可包括对表面进行干燥的任选步骤。

111、本发明的方法可以进一步包括对表面的光散射进行基线测量。这一步骤可以在上述步骤(ii)之后进行。基线测量可以作为对照测量。基线测量可以通过其光散射提供关于固定在表面上的任何目标的信息。此外，基线测量可提供随机释放事件的测量，提供基线，在该基线之上，释放事件被预期是特异性的并且值得的检测。

112、如本文所使用的，目标可以是表面上的任何目标，诸如没有或没有相关生物标志性的捕获剂，甚至是来自样品的其他组分。

113、本发明的方法可以包括任何合适的内部标准或对照。内部对照可用于测定相对浓度。本发明的方法可以包括任何合适的内部校准物。

114、该方法可用于确定样品中生物标志物的浓度。因此，该方法可以包括测量从捕获剂释放的生物标志物的量和/或从生物标志物/捕获剂复合物被固定的表面释放的生物标志物/捕获剂复合物的量。生物标志物的量可以用作疾病或病症的进展或严重性的指示。

115、生物标志物从捕获剂的释放和/或生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂从表面的释放可以如本文所述，并且与第一方面相关。

116、如本文所述，第二方面的方法可以包括一个或多个额外的步骤，特别是与第一方面相关。

117、第二方面的方法可用于确定受试者将发展所述疾病或病症的风险。

118、第二方面的方法可适用于选择将对其施用物质或组合物的受试者，或者将对其开具治疗或给药方案的受试者，其中所述物质或组合物或方案适用于治疗或预防与来自受试者的样品中生物标志物的存在或量相关的疾病或病症。如果所述样品中生物标志物的存在或不存在或量指示所述疾病或病症发展的存在或可能性，则可以选择受试者施用所述物质或组合物，或进行所述治疗或给药方案。

119、第二方面还提供了在受试者中治疗或预防根据第二方面被诊断患有所述疾病或病症或有可能发展所述疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用物质或组合物，或对其实施方案，从而有效治疗或预防受试者中的所述疾病或病症。

120、还提供了用于在受试者中治疗或预防根据第二方面被诊断患有的疾病或病症或有可能发展所述疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法中的物质或组合物。

121、还提供了物质或组合物在制备用于治疗或预防与生物标志物的存在、不存在或量相关的疾病或病症的药物中的用途，其中受试者根据第二方面的方法已被诊断患有疾病或病症或具有发展所述疾病或病症的可能性。

122、在第三方面，提供了一种试剂盒，其中该试剂盒包括适于实施本发明第一方面或第二方面的方法的工具。试剂盒可以包括选自以下的一项或更多项：合适的表面、捕获剂、缓冲液、校准图、根据本发明的方法使用的说明、样品收集装置、介导本文所述生物标志物或捕获剂释放的试剂、以及用于校准的一种或更多种标准生物标志物样品。