透明质酸裂解酶SinHL在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用

本发明涉及透明质酸裂解酶sinhl在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用，属于糖工程。

背景技术：

1、透明质酸(ha)是一种酸性非硫酸化线性糖胺聚糖。不同分子量的ha具有不同的生物活性，与高分子量透明质酸不同，低分子量透明质酸(10～100kda)和透明质酸寡糖(≤10kda)具有独特的生物学特性，如抗炎、抗肿瘤、促进伤口愈合、促进血管再生等功效，在医学领域具有广泛的应用。其中特定大小的透明质酸寡糖具有特定的生物学功能，如不饱和透明质酸二糖(δha2)能够抑制脂多糖(lps)诱导的炎症；透明质酸四糖(ha4)可促进新生血管的合成；透明质酸六糖(ha6)与人软骨细胞中的toll样受体和cd44受体结合诱导炎症；透明质酸八糖(ha8)和透明质酸十糖(ha10)可以刺激成纤维细胞增殖和胶原合成，并通过破坏大分子透明质酸与细胞受体之间的相互作用，选择性地杀死癌细胞。

2、目前商品化的透明质酸裂解酶，大多是来源于细菌透明质酸链霉菌(streptomyces hyalurolyticus)和兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)等，多为内切型透明质酸裂解酶，产物为不饱和透明质酸二糖(δha2)、四糖(δha4)、六糖(δha6)和八糖(δha8)等。而分离纯化单一分子量透明质酸寡糖的程序复杂，工艺难度大。外切型透明质酸裂解酶在降解透明质酸过程中只产生不饱和透明质酸二糖(δha2)，因此可以作为高效制备不饱和透明质酸二糖的重要工具，具有重要的应用价值。透明质酸外切酶tchly8c是迄今为止第一个报道的外切型专一降解透明质酸的透明质酸裂解酶，来源于一株嗜热放线菌，酶比活为10.9u/mg(li,y.,s.zhang,h.wu,x.wang,w.yu and f.han(2020)."biochemical characterization of a thermophilic hyaluronate lyasetchly8c from thermasporomyces composti dsm22891."international journal ofbiological macromolecules 165:1211-1218.)。因此发掘透明质酸外切酶以及通过酶解法高效生产并制备不饱和透明质酸二糖具有重要的研究意义和广泛的市场应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，尤其是现有外切型透明质酸裂解酶研究的不足，本发明提供了透明质酸裂解酶sinhl在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用，透明质酸裂解酶sinhl为外切酶，该酶不裂解硫酸软骨素(鲨鱼)和肝素，只特异性地裂解透明质酸，可专一性的生产不饱和透明质酸二糖(δha2)。

2、透明质酸裂解酶sinhl在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用。

3、根据本发明优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl来源于海豚链球菌(streptococcus iniae)，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、根据本发明优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl还包括序列seq id no.1经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有裂解透明质酸活性的衍生蛋白质。

5、根据本发明优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl是以透明质酸为专一性酶解底物。

6、根据本发明优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl为外切酶。

7、根据本发明优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl的制备方法为：根据seq id no.1所示的氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化后获得透明质酸裂解酶sinhl的编码基因；将编码基因插入到表达载体pet-28a(+)中构建重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌bl21(de3)，培养至对数生长期，然后经iptg诱导表达，收集菌体，破壁、纯化后得透明质酸裂解酶sinhl。

8、进一步优选的，所述透明质酸裂解酶sinhl的编码基因的核苷酸序列如seq idno.2所示。

9、根据本发明优选的，所述应用的方法为：以透明质酸为反应底物，在透明质酸裂解酶sinhl的作用下，于温度15～45℃、ph 5.0～9.0的条件下反应，得到产物不饱和透明质酸二糖。

10、根据本发明优选的，所述温度为35℃。

11、根据本发明优选的，所述ph为7.0。

12、根据本发明优选的，还可在反应体系中加入终浓度为2mm的ca2+或mn2+。

13、有益效果：

14、本发明所提供的透明质酸裂解酶sinhl特异性强，可将透明质酸降解为不饱和透明质酸二糖(△ha2)。本发明所提供的透明质酸裂解酶sinhl以外切方式降解透明质酸，可高效生产不饱和透明质酸二糖，相较于内切型透明质酸裂解酶，提高了不饱和透明质酸二糖的生产效率。本发明所提供的透明质酸裂解酶sinhl可在无缓冲盐的去离子水环境中降解透明质酸，减少了不饱和透明质酸二糖的下游纯化工艺步骤，提高了纯化效率；本发明通过大肠杆菌重组表达并纯化所得的透明质酸裂解酶sinhl的酶比活为63u/mg，是目前确切报道酶比活的嗜热放线菌(thermasporomyces composti)dsm22891来源透明质酸外切裂解酶tchly8c酶比活(10.9u/mg)的5.7倍。本发明的透明质酸裂解酶sinhl扩充了透明质酸裂解酶库，为不饱和透明质酸二糖(δha2)的工业化生产和商业化应用奠定了基础。

技术特征：

1.透明质酸裂解酶sinhl在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl来源于海豚链球菌(streptococcus iniae)，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl包括序列seq idno.1经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有裂解透明质酸活性的衍生蛋白质。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl是以透明质酸为专一性酶解底物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl为外切酶。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl的制备方法为：根据seq id no.1所示的氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化后获得透明质酸裂解酶sinhl的编码基因；将编码基因插入到表达载体pet-28a(+)中构建重组表达载体；将重组表达载体转化入大肠杆菌bl21(de3)，培养至对数生长期，然后经iptg诱导表达，收集菌体，破壁、纯化后得透明质酸裂解酶sinhl。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述透明质酸裂解酶sinhl的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以透明质酸为反应底物，在透明质酸裂解酶sinhl的作用下，于温度15～45℃、ph 5.0～9.0的条件下反应，得到产物不饱和透明质酸二糖。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述温度为35℃；

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，还可在反应体系中加入终浓度为2mm的ca2+或mn2+。

技术总结本发明涉及透明质酸裂解酶SinHL在专一性生产不饱和透明质酸二糖中的应用，属于糖工程技术领域。本发明所提供的透明质酸裂解酶SinHL以外切方式降解透明质酸，可高效生产不饱和透明质酸二糖，相较于内切型透明质酸裂解酶，提高了不饱和透明质酸二糖的生产效率。本发明的透明质酸裂解酶SinHL扩充了透明质酸裂解酶库，为不饱和透明质酸二糖(ΔHA2)的工业化生产和商业化应用奠定了基础。技术研发人员：肖敏,景艺文,于湘钒,刘磊,徐莉,蒋绪恺受保护的技术使用者：山东大学技术研发日：技术公布日：2024/8/1