免疫细胞的制备方法及其用于预防肿瘤或肿瘤复发的用途与流程

本技术涉及生物领域，具体的涉及疾病的治疗，更进一步的涉及免疫细胞的制备方法及其用于预防肿瘤或肿瘤复发的用途。

背景技术：

1、肿瘤是局部组织细胞增生所形成的恶性疾病。血液里的t细胞，nk细胞，cik细胞，dc等免疫细胞对肿瘤细胞都能进行查杀，但由于年龄增大免疫系统衰老或免疫力下降对肿瘤细胞查杀不够引发肿瘤。所以我们在血液里分离出免疫细胞进行扩增或武装。保证其战斗力和数量。对肿瘤的预防和肿瘤术后防复发有着至关重要的作用和效果。

2、树突状细胞(dc)于1973年发现,是机体功能最强的专职性抗原递呈细胞(apc),因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。dc是一组异型性细胞群,根据其不同的发育阶段可将其分为前体dc、未成熟dc(imdc)、成熟dc(mdc)。dc与肿瘤的发生、发展有着密切关系,能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。肿瘤患者外周血中有功能的成熟dc数量显著减少,未成熟dc大量积累。研究表明肿瘤细胞可产生多种可溶性因子,包括vegfm-csf、gm-csf、il-10等,活化jak2/stat3 途径从而诱导dc的分化障碍,导致未成熟dc细胞聚集使肿瘤患者体内成熟dc数量下降。最新研究表明肿瘤细胞还可通过分泌sema3a抑制dc的成熟和免疫学功能。因此，采用成熟的dc细胞进行癌症的治疗是重要的研究方向。

3、肿瘤患者体内存在多种类型的免疫抑制细胞其中调节性t细胞(treg)在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用。treg可以通过多种机制来抑制免疫效应细胞的功能,是肿瘤免疫逃逸的关键因素。这些机制包括分泌抑制性细胞因子抑制效应细胞功能、分泌颗粒酶和穿孔素杀伤效应细胞、干扰效应细胞的代谢功能。treg还可通过调控树突状细胞来影响其自身的分化和增殖等。在肿瘤微环境中,cd4+cd25+treg是目前研究的热点,其为对正向免疫应答(包括b细胞、t细胞、抗原递呈细胞等参与的免疫应答)起负向调控作用的cd4+t细胞亚群,具有免疫抑制性和免疫无能两大功能特征。cd4+cd25+treg具有免疫抑制效应,通过其t细胞受体(tcell receptor,tcr)活化成为抑制性效应t细胞,可抑制cd4+和cd8+t细胞的活性,抑制nk细胞、b细胞以及其他免疫细胞的功能,导致对肿瘤的免疫耐受,参与肿瘤的免疫逃逸,使肿瘤特异性t效应细胞不能扩增到一定水平以根除肿瘤。多项研究发现:在胃癌、结直肠癌、肝癌、白血病等不同实体肿瘤患者的外周血、淋巴结及肿瘤浸润区域组织中,均存在 cd4+cd25+treg比例增高的现象并且其增高水平与病程进展和临床病理存在显著相关性。以treg及相关免疫抑制性分子作为治疗靶点,通过特异性或非特异性的方法清除treg的数量、抑制treg的功能来开展肿瘤免疫治疗势必具有良好的临床应用前景。

4、此外，基于nk细胞的肿瘤生物治疗取得了较大进展，其中基于nk细胞天然免疫识别的肿瘤生物治疗途径有很多思路，如利用细胞因子、造血生长因子和免疫调节剂可以促进nk细胞活化性受体的表达和加强杀伤分子(如穿孔素、粒酶)的表达和功能，其中i型干扰素、il-2、il-12、il-15、il-18、il-21在体内外实验中均显示强有力的功效；靶向nk细胞抑制性受体的人源化单克隆抗体可促使nk细胞免疫识别谱偏向免疫活化，从而使nk细胞大量活化；采用rna干扰(rnai)技术消减nk细胞抑制性受体表达或直接转基因超高表达nk细胞活化性受体，使nk细胞易于活化而获得杀伤活性；构建表达嵌合受体的nk细胞，使该细胞的活化受体含有超高活性的胞内信号功能区而易于高度活化，或者使该细胞活化受体具有特定的识别特性(例如具备识别erb2的单链抗体多变区)，使该细胞可以靶向癌细胞；免疫放疗和免疫化疗方案大幅度提高nk细胞的抗癌功效。近期研究证明，适度放疗和化疗可以使肿瘤细胞高表达nk细胞活化受体识别(如nkg2d)的配基，使肿瘤细胞易于被nk细胞识别而清除；同时，还发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂可以诱导肿瘤细胞dr2，从而被nk细胞以trail途径杀伤；基于nk细胞的adcc效应设计生物治疗方案。采用治疗性单抗或治疗性双功能抗体结合nk细胞体内转输可以极大提高临床肿瘤生物治疗的疗效。

5、淋巴因子激活的杀伤细胞（lak）是一种具有杀伤肿瘤细胞能力的混合免疫细胞群体，由外周血单个核细胞经过体外培养，通过特定的细胞因子激活而产生。lak细胞主要由nk细胞和t淋巴细胞混合而成，具有自然杀伤能力和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（adcc）能力，可以识别并杀伤多种肿瘤细胞。lak细胞也可以分泌多种细胞因子，如白细胞介素-2（il-2）、干扰素-γ（ifn-γ）、肿瘤坏死因子-α（tnf-α）等，对免疫调节和抗肿瘤反应的调节具有重要作用。

6、目前，免疫细胞单独用于治疗癌症的效果还不有待进一步的提高，目前采用免疫细胞联合化疗药物或者单抗类药物是目前研究的重点方向，但是可成药的类型还不够多，有待开发和研究提高。

技术实现思路

1、本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种可以用于治疗癌症的含有免疫细胞的药物组合物。

2、具体的，本发明提供了免疫细胞lak细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

3、进一步的，本发明还提供了特异性针对egfr的单克隆抗体，所述抗体具体为e-4f6，其重链可变区序列如seq id no:1所示，轻链可变区序列如seq id no:2所示。

4、在一些实施方案中，本发明的抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区。

5、在一些实施方案中，本发明的重链可变区包含与选自 seq id no :1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者

6、( i ）包含选自 seq id no :1的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：或者

7、( ii ）包含与选自 seq id no :1的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在 cdr 区中。

8、在一些实施方案中，本发明的轻链可变区

9、 i ）包含与选自 seq id no :2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者 ii )包含选自 seq id no :2的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者 iii）包含与选自 seqid no :2的氨基酸序列相比具有1个或多个（优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个）的氨基酸改变（优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换）的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在cdr区中。

10、提供功能相似的氨基酸的保守替换表为本领域技术人员所公知。例如，氨基酸侧链的特性为疏水氨基酸（a、i、l、m、f、p、w、y、v）、亲水氨基酸（r、d、n、c、e、q、g、h、k、s、t），以及具有如下共同的官能团或特性的侧链：脂肪族侧链（g、a、v、l、i、p）；含有侧链（s、t、y）的羟基；含有侧链（c、m）的硫原子；含有侧链（d、n、e、q）的羧酸和氨基化合物；含有侧链（r、k、h）的碱基；以及含有侧链（h、f、y、w）的芳香烃。另外，如下8组中，每组包括彼此保守置换的氨基酸。1）丙氨酸（a），甘氨酸（g）；2）天冬氨酸（d），谷氨酸（e）；3）天冬酰胺（n），谷氨酸盐（q）；4）精氨酸（r），赖氨酸（k）；5）异亮氨酸（i），亮氨酸（l），蛋氨酸（m），缬氨酸（v）；6）苯基丙氨酸（f），酪氨酸（y），色氨酸（w）；7）丝氨酸（s），苏氨酸（t）；以及8）半胱氨酸（c），蛋氨酸（m）。

11、进一步的，本发明提供了一种用于治疗癌症的药盒，所述药盒含有本发明的免疫细胞lak细胞和特异性针对egfr的单克隆抗体egfr-3d7。

12、具体的，所述的药盒含有药学上可接受的载体。包括赋形剂，润湿剂，表明活性剂或者其他合适ph调节剂。

13、具体的，“药学可接受的载体”是用于将本文公开并要求保护的发明构思的化合物递送至人或动物的药学可接受的溶剂、悬浮剂或媒介物。载体可以为液体或固体，并且根据思想上计划的施用方式来选择。可以按照本文公开并要求保护的发明构思利用的药学可接受的载体的实例包括但不限于peg、脂质体、乙醇、dmso、水性缓冲液、油以及它们的组合。

14、适合的药学上可接受的润湿剂或表面活性剂的实例包括但不限于两性、非离子型、阳离子型或阴离子型分子。适合的表面活性剂包括但不限于聚山梨酯、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、十二烷基二甲基氧化胺、多库酯钠、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脱水山梨醇、辛苯昔醇、n,n-二甲基十二烷基胺-n-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧乙烯(10)月桂醚、 表面活性剂(由月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇衍生的植物油系脂肪醇聚氧乙烯醚)、胆盐(例如脱氧胆酸钠和胆酸钠)、聚氧乙烯蓖麻油、壬基酚乙氧基化物、环糊精、卵磷脂、甲苄索氯铵、羧酸盐、磺酸盐、石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐、萘磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、硫酸盐、硫酸化天然油和脂肪、硫酸化酯、硫酸化烷醇酰胺、烷基酚(乙氧基化和硫酸化的)、乙氧基化脂肪醇、聚氧乙烯表面活性剂、羧酸酯、聚乙二醇酯、脱水山梨醇酯及其乙氧基化衍生物、脂肪酸乙二醇酯、羧酰胺、单烷醇胺缩合物、聚氧乙烯脂肪酸酰胺、季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯脂环族胺、n,n,n,n-四取代乙二胺、2-烷基-1-羟乙基-2-咪唑啉、n-椰油基-3-氨基丙酸/钠盐、n-牛脂基-3-亚氨基二丙酸二钠盐、n-羧甲基-n,n-二甲基-n-9-十八烯基氢氧化铵、n-椰油酰胺乙基-n-羟乙基甘氨酸钠盐等、聚氧乙烯、脱水山梨醇单月桂酸酯和硬脂酸酯、 (聚乙氧基化蓖麻油)、 (环氧乙烷/12-羟基硬脂酸)、聚山梨酯、四丁酚醛，以及它们的任意组合。优选的药学上可接受的表面活性剂包括四丁酚醛和(脱水山梨醇单油酸酯)或其混合物。

15、在一个实施方案中，所述药学上可接受的润湿剂或表面活性剂的存在量为约0.01％至约5.0％(重量/体积)，优选约0.05％至约2.0％(重量/体积)，更优选约0.1％至约1.0％(重量/体积)，例如约0.1％、0.2％、0.5％、1.0％(重量/体积)。

16、适合的药学上可接受的等渗调节剂的实例包括但不限于d-甘露醇、葡萄糖、甘油、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁或它们的任意组合。也可以使用各种硝酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或它们的混合物。在一个实施方案中，所述药学上可接受的等渗调节剂的存在量为约0.1％至约5.0％(重量/体积)，优选约1％至约3％(重量/体积)。

17、进一步的，本发明的单抗还可以与本领域常用其他药物形成缀合物。

18、具体的，本发明的抗体-配体缀合物可任选地包含两个或两个以上接头。这些接头可以相同或不同。例如，肽基接头可能用于将药物连接到配体上，并且第二肽基接头可将诊断剂附着到复合体上。另外的接头的其他用途包括将分析剂、生物分子、靶向剂、以及可检测标记连接到抗体-配偶体复合体。

19、同样在本发明的范围之内的是本发明的抗体，它们是多价(poly-或multi-)的种类，包括，例如，诸如本发明的抗体或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体、或更高的同系物的种类。多价的种类可由本发明的单一种类或多于一个种类装配而成。例如，二聚体构建体可为“均二聚体”或者“异二聚体”。此外，多价的构建体(例如聚赖氨酸、葡聚糖、羟乙基淀粉等)也是在本发明的范围内。

20、具体的，本发明提供了免疫细胞lak细胞联合egfr单克隆抗体e-4f6在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。所述抗体的重链可变区序列如seq id no:1所示，轻链可变区序列如seq id no:2所示。

21、有益效果

22、本发明提供了特异性的免疫lak细胞能够具有较好的癌细胞杀伤特性，将其与特异性针对egfr的靶向单克隆抗体联用后能够显著的协同的杀伤癌细胞的作用，应用前景广阔。