含有叠氮基团免洗型荧光探针及其制备方法与应用

本发明属于化学医药，具体涉及含有叠氮基团免洗型荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、荧光探针在科学研究和应用中扮演着重要角色，具有实时成像、深度可视化等优点，使其广泛应用于生物成像、药物递送、生物分子传感等领域。其中，光激活荧光探针基于光笼基团的淬灭活性，无需涉及其他物质，通过光照控制，荧光探针会发生光解反应，从而恢复荧光团明亮荧光，具有清洁、方便、高效等特点。这些特点使得各种生物成像技术成为可能，包括单分子定位显微成像和超分辨率显微成像，揭示了以前无法观察到的生物结构和过程。

2、细胞器作为物质和能量代谢的重要载体，其独特的生物功能分子有序调控，支持区室内各类生化反应的高效进行，在细胞功能中起着关键作用。利用特定细胞器探针进行细胞成像，研究细胞器动态互作，可以帮助我们更好地理解细胞功能，而合适的细胞器染料或探针对特定细胞器进行特异性示踪是分子基础。目前商业化细胞器成像探针为“常亮”型，在细胞培养液中背景噪音高，易产生非特异性荧光，不利于观察，并且需要经过繁琐的洗涤步骤除去背景干扰。基于上述问题，需要对荧光探针进行改进。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种含有叠氮基团免洗型荧光探针，光响应速率快、光稳定性好、高时空分辨率。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种含有叠氮基团免洗型荧光探针，所述荧光探针为选自化合物i、化合物ii、化合物iii中的一种：

4、

5、

6、本发明的目的之二在于提供一种含有叠氮基团免洗型荧光探针的制备方法，合成步骤少，且原料经济，后处理过程简单。

7、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

8、上述含有叠氮基团免洗型荧光探针的制备方法，当所述荧光探针为化合物i时，其制备过程包括以下步骤：

9、

10、①.将7-氨基-4-羧甲基香豆素溶于无机溶剂1，冰浴条件下加入亚硝酸钠搅拌反应50-70min，加入叠氮化钠搅拌反应4-6h，得到中间体1；

11、②.将上述中间体1溶于有机溶剂1，在缩合剂的作用下反应，再加入4-(4-氨基-1-丁基)吗啉、n,n-二异丙基乙胺于室温下反应11-13h，获得化合物i荧光探针；

12、当所述荧光探针为化合物ii时，其制备过程包括以下步骤：

13、

14、i.将4-溴-1,8-萘二甲酸酐、叠氮化钠溶于有机溶剂1搅拌反应11-13h，获得中间体2；

15、ii.将中间体2、4-二甲氨基吡啶溶于有机溶剂2搅拌反应8-12min，再加入β-丙氨酸，于75-85℃下回流11-13h，获得中间体3；

16、iii.在惰性气体保护下，将甲酰胺、1,4-丁二胺加热回流4-6h，纯化后溶于添加三乙胺的有机溶剂3，冰浴条件下，加入添加对甲苯磺酰氯的有机溶剂3，室温下反应14-16h，再加热回流4-6h，使用氢氧化钠溶液调节ph，获得中间体4；

17、iv.将上述中间体3溶于有机溶剂1，在缩合剂的作用下反应，再加入中间体4、n,n-二异丙基乙胺反应11-13h，获得化合物ii荧光探针；

18、当所述荧光探针为化合物iii时，其制备过程包括以下步骤：

19、

20、a.将n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、三苯基磷溶于有机溶剂4，回流23-25h，加入水合肼、有机溶剂5，回流17-19小时，获得中间体5；

21、b.将10-溴-1,9-蒽二甲酸酐溶于有机溶剂5，加入三乙胺、中间体5，回流11-13h，获得中间体6；

22、c.将中间体6溶于有机溶剂1，反应25-35min后加入叠氮化钠，于95-105℃下回流55-65min，获得化合物iii荧光探针。

23、进一步地，步骤①中所述7-氨基-4-羧甲基香豆素、亚硝酸钠、叠氮化钠的摩尔比为1：(1-2)：(1-2)；步骤②中所述中间体1、缩合剂、4-(4-氨基-1-丁基)吗啉、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1：(1-3)：(2-3)：(2-4)。

24、进一步地，步骤①中所述7-氨基-4-羧甲基香豆素的浓度为0.13-0.28mmol/ml；步骤①中所述无机溶剂1为盐酸，所述盐酸的质量分数为15-20％；步骤②中所述中间体1的浓度为0.04-0.08mmol/ml。

25、进一步地，步骤i中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、叠氮化钠的摩尔比为1：(1-2)；步骤ii中所述中间体2、4-二甲氨基吡啶、β-丙氨酸的摩尔比为1：(0.05-0.2)：(1-2)；步骤iii中所述甲酰胺、1,4-丁二胺、三乙胺、对甲苯磺酰氯的摩尔比为1：(2-4)：(0.5-1.5)：(1-2)，所述氢氧化钠溶液调节ph至10-11；步骤iv中所述中间体3、中间体4、缩合剂、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1：(1-2)：(1-3)：(2-4)。

26、进一步地，步骤a中所述n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、三苯基磷、水合肼的摩尔比为1：(2-4)：(4-6)；步骤b中所述10-溴-1,9-蒽二甲酸酐、中间体5、三乙胺的摩尔比为1：(1-2)：1；步骤c中所述中间体6、叠氮化钠的摩尔比为1：(1.5-3)。

27、进一步地，所述有机溶剂1为n,n-二甲基甲酰胺；所述缩合剂为hatu；所述有机溶剂2为无水乙醇；所述有机溶剂3为二氯甲烷；所述有机溶剂4为乙腈；所述有机溶剂5为无水甲醇。

28、本发明的目的之三在于提供一种含有叠氮基团免洗型荧光探针的应用。

29、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

30、上述含有叠氮基团免洗型荧光探针的应用，在特异性标记细胞器中的应用。

31、进一步地，当所述荧光探针为化合物i时，所述细胞器为溶酶体；当所述荧光探针为化合物ii时，所述细胞器为内质网；当所述荧光探针为化合物iii时，所述细胞器为线粒体。

32、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

33、(1)本发明荧光探针为“光激活”型，在细胞培养液中为荧光淬灭态，经内吞作用快速进入细胞后，叠氮基团在细胞内微环境中快速光解，并释放明亮荧光，结合不同细胞器分子靶标的简单偶联，进而直观、动态地实现细胞器特异性荧光成像的目的。

34、(2)本发明的荧光探针染色方便、无须清洗，具有生物相容性好、光响应速率快、光稳定性高、高时空分辨率、优异的靶向性能以及较强荧光信噪比等优点。

35、(3)本发明荧光探针的制备方法，合成步骤少、原料经济，后处理过程简单。

技术特征：

1.一种含有叠氮基团免洗型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自化合物i、化合物ii、化合物iii中的一种：

2.如权利要求1所述含有叠氮基团免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，当所述荧光探针为化合物i时，其制备过程包括以下步骤：

3.如权利要求2所述含有叠氮基团的免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤①中所述7-氨基-4-羧甲基香豆素、亚硝酸钠、叠氮化钠的摩尔比为1：(1-2)：(1-2)；步骤②中所述中间体1、缩合剂、4-(4-氨基-1-丁基)吗啉、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1：(1-3)：(2-3)：(2-4)。

4.如权利要求2所述含有叠氮基团的免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤①中所述7-氨基-4-羧甲基香豆素的浓度为0.13-0.28mmol/ml；步骤①中所述无机溶剂1为盐酸，所述盐酸的质量分数为15-20％；步骤②中所述中间体1的浓度为0.04-0.08mmol/ml。

5.如权利要求2所述含有叠氮基团的免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤i中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐、叠氮化钠的摩尔比为1：(1-2)；步骤ii中所述中间体2、4-二甲氨基吡啶、β-丙氨酸的摩尔比为1：(0.05-0.2)：(1-2)；步骤iii中所述甲酰胺、1,4-丁二胺、三乙胺、对甲苯磺酰氯的摩尔比为1：(2-4)：(0.5-1.5)：(1-2)，所述氢氧化钠溶液调节ph至10-11；步骤iv中所述中间体3、中间体4、缩合剂、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1：(1-2)：(1-3)：(2-4)。

6.如权利要求2所述含有叠氮基团的免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤a中所述n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、三苯基磷、水合肼的摩尔比为1：(2-4)：(4-6)；步骤b中所述10-溴-1,9-蒽二甲酸酐、中间体5、三乙胺的摩尔比为1：(1-2)：1；步骤c中所述中间体6、叠氮化钠的摩尔比为1：(1.5-3)。

7.如权利要求2所述含有叠氮基团的免洗型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂1为n,n-二甲基甲酰胺；所述缩合剂为hatu；所述有机溶剂2为无水乙醇；所述有机溶剂3为二氯甲烷；所述有机溶剂4为乙腈；所述有机溶剂5为无水甲醇。

8.如权利要求1-7任一项所述含有叠氮基团免洗型荧光探针的应用，其特征在于，在特异性标记细胞器中的应用。

9.如权利要求8所述含有叠氮基团免洗型荧光探针的应用，其特征在于，当所述荧光探针为化合物i时，所述细胞器为溶酶体；当所述荧光探针为化合物ii时，所述细胞器为内质网；当所述荧光探针为化合物iii时，所述细胞器为线粒体。

技术总结本发明属于化学医药技术领域，具体涉及含有叠氮基团免洗型荧光探针及其制备方法与应用。该含有叠氮基团免洗型荧光探针选自化合物I、化合物II、化合物III中的一种：本发明的免洗型荧光探针在细胞培养液中为无荧光状态，经内吞作用快速进入细胞后，叠氮基团在细胞内微环境中快速光解，并释放出明亮荧光，具有生物相容性好、光响应速率快、光稳定性高、高时空分辨率、优异的靶向性能以及较强荧光信噪比等优点。本发明含有叠氮基团免洗型荧光探针的制备方法，合成步骤少、原料经济、后处理过程简单。技术研发人员：邢盼飞,魏慧慧,谢明利,郭正隆,姜沁宏受保护的技术使用者：河南大学技术研发日：技术公布日：2024/8/1