一种鉴定苹果果糖含量的dCAPS分子标记及应用

本发明属于果树品质性状分子标记开发和分子标记辅助育种，具体涉及与苹果果实果糖含量紧密连锁的snp和dcaps分子标记及应用。

背景技术：

1、有机酸和可溶性糖是成熟果实感官品质重要的组成成分。成熟果实中可溶性糖和有机酸的浓度取决于生物合成、降解和液泡存储之间的平衡。此外，不同的可溶性糖组分，如蔗糖、果糖和葡萄糖，赋予苹果果实不同的甜味。同样，柠檬酸、苹果酸和酒石酸的酸度也大有不同。因此，果实的味道取决于可溶性糖和有机酸的种类、含量和相对比例，保持糖酸含量的相对平衡，对于培育一个理想的苹果品种至关重要。

2、果实糖酸含量是较为复杂的品质性状，易受到遗传、激素、外部环境、人为栽培措施等多方面影响。目前对已有苹果品种进行大量糖酸种类及含量研究表明，果糖是苹果果实主要的可溶性糖，约占总糖的44-75％，而苹果酸是苹果果实中的主要有机酸，约占总有机酸含量的90％。传统育种对苹果果实糖酸含量的选育主要依据表型进行选择，选育结果准确性受环境影响较大，且苹果生长周期长，传统选育方法耗时费力。因此，构建高密度遗传图谱，结合多年果实表型数据测定，对果实性状进行精确qtl定位，挖掘调控目标性状的关键基因和与之连锁的snp位点，结合分子标记辅助育种工作进行选育，能显著提高育种者选育品种效率，减轻田间工作量，降低育种成本，还可进一步提高产品质量与品质，促进相关产业发展。

3、dcaps标记是基于caps(酶切扩增多态性序列)标记衍生出来的一种分子标。若snp标记正好处于某一酶切位点上，则可通过对扩增产物的酶切区分该位点不同snp的样本，即为caps标记。若snp处没有酶切位点，则可通过在扩增引物中引入错配碱基的序列(由于引物往往设计的很长，超过30bp，因此少数错配不会影响pcr扩增)，使产物在pcr扩增后结合snp位点引入新的限制性内切酶位点，同样可以导致错配引物被酶切，从而进行基因型区分，即为dcaps标记。

4、苹果(malus×domestica)生态适应性强，栽培广泛，是重要的经济作物之一，我国苹果栽培面积和产量都居世界首位。果实糖酸含量是苹果重要的品质性状，影响果实的经济价值，是产业升级的关键。本发明通过‘嘎啦’(malus domestica borkh)、‘夏红肉’(malus sieversii)的f1杂种分离群体，利用全基因组重测序手段，构建高密度遗传连锁图谱。结合两年的农艺性状数据，进行果实糖酸含量qtl定位，挖掘出苹果果肉糖酸积累和调控的关键基因，并开发dcaps分子标记，可为资源高效利用型苹果分子设计育种提供重要的技术与材料基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种鉴定苹果果糖含量的dcaps分子标记及应用，根据qtl定位获取的目标基因的单倍型序列，获得一个鉴定苹果果糖含量的dcaps分子标记，并且此标记利用琼脂糖凝胶电泳可以清晰地显示差异，便于应用于筛选果实糖酸含量不同的苹果品种。

2、本发明技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供一个苹果果实果糖和苹果酸含量调控基因mdnadp-me，栽培苹果(‘嘎啦’)和野生苹果(‘夏红肉’)中mdnadp-me启动子两种单倍型序列对比结果如图1所示，鉴定到栽培苹果与野生型苹果在mdnadp-me基因的启动子区域存在多个单核苷酸多态性(snp)变异。

4、本发明的第二方面，提供一个苹果果糖含量的snp分子标记，所述snp分子标记位于mdnadp-me基因的启动子区域中，具体位于苹果基因组第15号染色体全长序列的第15,484,856个碱基，snp的变异位点为c/a。

5、本发明的第三方面，提供与苹果果肉果糖含量相关的dcaps分子标记，所述dcaps分子标记包含特异性检测苹果基因组gddh13 v1.1第15号染色体全长序列的第15,484,856位的snp位点，snp的变异位点为c/a；所述dcaps分子标记的核苷酸序列如seq id no:1所示：5’-tcaatcacgcaagtactctaaattactatttgaaaaattttatttaaa ttcatgtaacttctttttacacctacttaaattttaaatattaattgtcatt ttcacatgattgtataattactattaagcataaaataaaattaataataaa actcaaatttcttaataaatccacccactatgattaaacca/ctagcatctctctttatttatccata-3’。其中加下划线的g为引物引入的突变碱基，c为参考基因组及‘嘎啦’在此snp位点的对应碱基，a为‘夏红肉’在此snp位点的突变碱基。

6、所述引物序列如seq id no:2所示的正向引物和seq id no:3所示的反向引物，具体如下：

7、正向引物dcaps-f：5’-tcaatcacgcaagtactctaaatta-3’(seq id no:2)

8、反向引物dcaps-r：5’-tatggataaataaagagagatgcta-3’(seq id no:3)

9、利用该引物对对待测苹果基因组dna进行特异性扩增，所得到的pcr扩增产物大小为217bp，经过限制性内切酶fspbi(酶切位点为c/tag)酶切后得到特异性条带。若获得的酶切产物分别为192bp和25bp的两条片段，则待测苹果材料基因型为纯合的cc，为果糖含量高的材料；若获得的酶切产物分别为217bp、192bp和25bp的三条片段，则待测苹果材料基因型为杂合的ac，为果糖含量低的材料；若获得的酶切产物是长度为217bp的一条片段，则待测苹果材料基因型为纯合的aa。

10、本发明进一步保护一种鉴定苹果果糖含量高低的方法，包括以下步骤：

11、1)提取待测苹果的基因组dna；

12、2)采用上述特异性引物对基因组dna进行扩增；

13、3)用限制性内切酶fspbi对扩增产物进行酶切；

14、4)电泳，若酶切产物中仅含有192bp和25bp的两条片段，则待测苹果为果糖含量高，且基因型为纯合cc的材料；若酶切后产物中具有217bp、192bp和25bp三条片段，则待测苹果为果糖含量低，且基因型为杂合ac的材料；若酶切产物中仅含有217bp的一条片段，则待测苹果材料基因型为纯合的aa。

15、进一步地，步骤2)中，pcr反应体系为：100～200ng/μl苹果基因组dna 1.0μl，2×hieffpluspcrmastermix12.5μl，dcaps上下游引物各1μl，ddh2o9.5μl。

16、pcr程序为：94℃预变性，5分钟；94℃，30s(变性)，60℃，30s(退火)，72℃，60s/1kb(延伸)，30个循环；最后72℃，延伸10min。

17、本发明具有如下有益效果：

18、本发明利用挖掘的mdnadp-me基因的启动子区域的与苹果果肉果糖含量相关的snp信息设计出一对特异性的引物，用该引物扩增dna片段，接着用限制性内切酶酶切pcr产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段来鉴定不同的苹果材料；开发出dcaps分子标记，可以用于苗期鉴定苹果果实果糖含量高低这一重要品质性状。利用该标记方法不仅节约了田间育种成本，同时缩短了育种周期，加速了苹果育种进程。