一种检测昆虫细胞系中弹状病毒的荧光定量PCR引物探针组及方法与流程

本发明属于生物，涉及一种检测昆虫细胞系中弹状病毒的荧光定量pcr引物探针组及方法。背景信息昆虫杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system，bevs)是由smith于1983年构建的真核细胞表达系统，该系统能对表达的重组蛋白进行多种翻译后修饰，如二硫键形成、磷酸化、酰化、糖基化、寡聚化和折叠等。其构建简单，易于放大，效率高，既可表达单一的抗原蛋白，也可表达复合蛋白，并可在细胞内形成具有良好抗原性的病毒样颗粒，现已被广泛用于外源蛋白表达、药物筛选、疫苗开发、基因治疗等领域。bevs因其安全性高、操作简便、可用于多亚基蛋白同时表达、适用于大规模培养等优势，具有极大的发展前景。分离自鳞翅类昆虫草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)卵巢上皮细胞的sf-9是杆状病毒表达系统中常用的昆虫细胞基质，该细胞株是由g.e.smith和c.l.cherry从iplb-sf-21-ae克隆而来，细胞形态更加均一，对核型多角体病毒敏感，适用于分泌蛋白的表达。2014年，几乎同一时间由3个不同团队在不同的sf细胞系中独立发现了弹状病毒，这种病毒现在被称为新弹状病毒以(sf-rhabdoviru,sf-rv)。后续研究表明，sf-21、sf-9l5814和sf-9细胞系均表现出新弹状病毒污染。虽然sf-rv的宿主范围相对较窄，可能仅限于少数鳞翅目昆虫物种和细胞系，目前也尚未发现sf-rv在哺乳动物细胞株中引起细胞病变的报道。但出于安全性考虑，研发基于bevs表达系统的产品时，应使用去除sf-rv污染的细胞系。目前对于sf-rv检测的研究较少，现有的方法大多基于反转录pcr，该方法检测灵敏度较低，已造成漏检；且操作耗时较长，成本较高。因此，开发能准确、快捷、有效的检测sf-rv的技术和试剂盒对bevs的安全性评价是至关重要的。

背景技术：

技术实现思路

1、本发明涉及一种检测昆虫细胞系中弹状病毒的荧光定量pcr引物探针组及方法。目的是快速、简便和准确的从昆虫细胞系中检出sf-rv污染。

2、本发明首先提供一段用于检测弹状病毒的靶点，靶点具有seq id no.1所示序列或特异性片段。

3、本发明还提供一种检测sf-rv的荧光定量pcr引物探针组，包括一对特异性引物和一个taqman探针，所述的特异性引物的核苷酸序列如seq id no.2-3所示，所述的taqman探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4、优选的，所述的荧光报告基团为fam，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

5、本发明所述的靶点、所述的引物探针组在昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染检测中的应用。

6、本发明还提供一种检测昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染的方法，所述方法为以本发明所述的靶点为检测目标，以反转录荧光pcr的方法进行检测。

7、本发明还提供了一种含有上述引物探针组合的反转录荧光pcr扩增体系：

8、

9、去离子水补足至25μl

10、本发明还提供一种pcr反应程序：

11、

12、循环步骤③-④30-40次。

13、优选的，本发明所述的pcr反应程序具体参数如下：

14、

15、循环步骤③-④35次。

16、本发明所述的昆虫细胞系中弹状病毒污染检测方法具有如下优势：

17、①检测靶点特异，能精准的检出昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染，而不受昆虫细胞基因组等干扰。

18、②检测灵敏度高，最低能检出5copie/μl的靶基因，结果与二代测序一致，不漏检。

19、③检测方便快捷，较普通pcr方法工作量少，较测序方法成本低。

20、说明书附图

21、图1模板浓度为5×10^5～5×10^0copies/μl时扩增曲线；

22、图2.反应体系扩增效率＝94.4％。

技术特征：

1.一段用于检测弹状病毒的靶点，所述靶点具有seq id no.1所示序列或特异性片段。

2.一种检测sf-rv的荧光定量pcr引物探针组，其特征在于，包括一对特异性引物和一个taqman探针，所述的特异性引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示，所述的taqman探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3.根据权利要求2所述的检测sf-rv的荧光定量pcr引物探针组，其特征在于，taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的检测sf-rv的荧光定量pcr引物探针组，其特征在于，所述的荧光报告基团为fam。

5.根据权利要求3所述的检测sf-rv的荧光定量pcr引物探针组，其特征在于，所述的荧光淬灭基团为bhq1。

6.权利要求1所述的靶点、权利要求2-5所述的引物探针组在昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染检测中的应用。

7.一种检测昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1所述的靶点为检测目标，以反转录荧光pcr的方法进行检测。

8.根据权利要求7所述的检测昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染的方法，其特征在于，反转录荧光pcr扩增体系为：

9.根据权利要求7所述的检测昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染的方法，其特征在于，pcr反应程序为：

10.根据权利要求7所述的检测昆虫细胞系sf9中弹状病毒污染的方法，其特征在于，pcr反应程序具体参数如下：

技术总结本发明公开一种检测昆虫细胞系中弹状病毒的荧光定量PCR引物探针组及方法，本发明提供一段用于检测弹状病毒的靶点，靶点具有SEQ ID NO.1所示序列或特异性片段，并开发基于此的检测昆虫细胞系中弹状病毒的荧光定量PCR检测方法。本发明所述的检测靶点特异性强，能精准的检出昆虫细胞系Sf9中弹状病毒污染，而不受昆虫细胞基因组等干扰。检测灵敏度高，最低能检出5copie/μL的靶基因，结果与二代测序一致，不漏检。检测方便快捷，较普通PCR方法工作量少，较测序方法成本低。技术研发人员：陈凯,李丽,高正伦受保护的技术使用者：北京先声祥瑞生物制品股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1