一种微生物及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种分离自土壤的微生物及其在农业、临床医疗中的应用。

背景技术：

1、透明质酸酶有两大类。一类是透明质酸水解酶，来源于动物；一类是透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase)，来源于微生物。动物来源的酶，虽能分解透明质酸，但最终产物以四糖和六糖为主，活力低、成本高，而且有动物病毒安全风险等问题。来源于微生物的酶，虽然可以比来源于动物的酶分解更为彻底，但不同微生物对碳源的利用完全不同，导致其降解透明质酸的能力差异显著。

2、对此，本技术从土壤中筛选一株可以高效裂解透明质酸的微生物，除可以裂解透明质酸外还可以裂解硫酸软骨素。进一步通过分析获得微生物中高效裂解透明质酸的酶的氨基酸序列，将其原核表达后，依然具有裂解能力。

技术实现思路

1、具体的：

2、本发明的第一方面，提供了一种微生物，所述的微生物为植物内生菌(phytobacter sp.)had-10，所述的微生物于2024年02月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmcc no.29875。

3、保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4、所述的微生物的16s rrna的核苷酸序列如seq id no：1所示。

5、本发明的第二方面，提供了一种降解糖胺聚糖的方法，所述的方法包括使用上述的微生物。

6、优选的，所述的糖胺聚糖包含β1-3糖苷键和/或β1-4糖苷键。

7、优选的，所述的糖胺聚糖包含透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素中一种或两种以上。

8、优选的，所述的硫酸软骨素包括cs-a、cs-b、cs-c、cs-d、cs-e、cs-f、cs-h、cs-k、cs-l或cs-m中的一种或两种以上。

9、在本发明的一个具体实施方式中，所述的硫酸软骨素包括cs-a、cs-c或cs-d中的一种、两种或三种。

10、优选的，所述的微生物表达seq id no：3或与seq id no：3具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上同源性的氨基酸序列。

11、优选的，所述的微生物的基因组中包含seq id no：2或与seq id no：2具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上同源性的核苷酸序列。

12、优选的，所述的方法包括培养上述的微生物，将培养上清液与待降解的糖胺聚糖混合。

13、进一步优选的，所述的方法包括培养上述的微生物，收集上清液后，离心并收集沉淀；将沉淀与待降解的糖胺聚糖混合。

14、优选的，所述的离心可以为一次或两次以上。

15、优选的，离心前还包括加入硫酸铵的步骤，优选加入80％的硫酸铵。

16、优选的，混合的反应时间为1-5h，优选1-3h，例如1、2、3、4、5h。

17、优选的，混合的反应温度为30-40℃，优选35-40℃，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃。

18、优选的，所述的方法还包括对沉淀进行重悬。优选使用悬浮缓冲液进行重悬，优选的，所述悬浮缓冲液为任何适于培养细胞的缓冲液，例如pbs、tris缓冲液或甘氨酸缓冲液。在本发明的一个具体实施方式中，所述悬浮缓冲液为pbs。

19、在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括：

20、1)摇瓶培养所述的微生物，收集上清液(优选为胞外上清液)；

21、2)在1)中收集的上清液中加入硫酸铵(优选加入80％的硫酸铵)，离心并收集沉淀；

22、3)重悬2)中收集的沉淀；

23、4)加入待降解的糖胺聚糖。

24、优选的，所述的方法包括将包含如seq id no：3或与seq id no：3具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上同源性的氨基酸序列的蛋白与待降解的糖胺聚糖混合。

25、优选的，包含如seq id no：3或与seq id no：3具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上同源性的氨基酸序列的蛋白的制备方法包括：

26、将编码seq id no：3或与seq id no：3具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列(优选包含seq id no：2的核苷酸序列)导入宿主细胞，诱导其表达；

27、优选所述的制备方法还包括纯化。

28、优选的，加入待降解的糖胺聚糖后反应时间为1-5h，优选1-3h，例如1、2、3、4、5h。

29、优选的，加入待降解的糖胺聚糖后反应温度为30-40℃，优选35-40℃，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃。

30、优选的，所述的糖胺聚糖为透明质酸，降解后的产物包括小分子透明质酸，优选的，所述的小分子透明质酸包括透明质酸寡糖或galnac单糖。

31、本发明的第三方面，提供了上述降解糖胺聚糖的方法获得的小分子透明质酸。

32、本发明的第四方面，提供了一种上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白的应用，

33、所述的应用包括：

34、1)在降解糖胺聚糖中的应用；

35、2)在制备小分子透明质酸中的应用；

36、3)在制备抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨生成、促进血管生成、调节免疫、抗氧化自由基或修复细胞损伤的产品中的应用。

37、优选的，所述的产品包括药物、食品或化妆品中的一种或两种以上。

38、优选的，所述的产品包括通过上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白降解糖胺聚糖的产物，例如小分子透明质酸。

39、优选的，所述的糖胺聚糖包含β1-3糖苷键和/或β1-4糖苷键。

40、优选的，所述的糖胺聚糖包含透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素中一种或两种以上。

41、优选的，所述的硫酸软骨素包括cs-a、cs-b、cs-c、cs-d、cs-e、cs-f、cs-h、cs-k、cs-l或cs-m中的一种或两种以上。在本发明的一个具体实施方式中，所述的硫酸软骨素包括cs-a、cs-c或cs-d中的一种、两种或三种。

42、优选的，所述的小分子透明质酸包括透明质酸寡糖或galnac单糖；

43、优选的，所述的galnac单糖包括饱和galnac单糖和/或不饱和galnac单糖。

44、优选的，所述的透明质酸寡糖包括饱和透明质酸寡糖和/或不饱和透明质酸寡糖。

45、优选的，所述的透明质酸寡糖包括偶数寡糖；

46、优选的，所述的偶数寡糖包括透明质酸二糖、透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖或透明质酸十糖中的一种或两种以上。

47、优选的，所述的透明质酸寡糖包括奇数寡糖；

48、优选的，所述的奇数寡糖包括透明质酸三糖、透明质酸五糖、透明质酸七糖或透明质酸九糖中的一种或两种以上。

49、优选的，所述的药物包含上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白，或，通过上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白降解糖胺聚糖的产物。

50、优选的，所述的药物还包含药学上可接受的辅料。

51、优选的，所述的药学上可接受的辅料包括载体(例如吸附载体)、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、悬浮剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂或稳定剂中的一种或两种以上的组合。

52、优选的，所述药物的制剂形式可以为糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂或乳剂中任一种或两种以上的组合。

53、优选的，所述的药物的制剂类型优选为单位剂量制剂。单位剂量制剂中药物活性组分的量可从0.001毫克到1000毫克之间(优选为0.1毫克到500毫克之间，进一步优选30毫克到100毫克之间，例如0.001、0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000毫克)改变或调整，根据活性组分的具体应用和效力而定。根据具体实施方式的需要，组合物还可包含其它适合的治疗剂。

54、所述的药物适于肠胃给药或非肠胃给药。

55、优选的，适于肠胃给药例如口服给药、肠内给药或经导管给药的制剂包括口服剂(例如胶囊、囊剂、药丸、片剂、锭剂、粉末、颗粒剂、水或非水溶液或悬浮液、油包水或水包油的乳剂、酏剂或糖浆)、直肠栓剂或直肠灌肠剂中的一种或两种以上。

56、优选的，适于非肠胃给药例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径给药的制剂包括含水和非水的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使制剂与接受者的血液等渗的溶质，以及含水和非水的无菌悬浮剂，其可包含助悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。制剂可存在于单位剂量或者多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中。注射用溶液和悬浮液可从先前所述类型的无菌粉剂、颗粒和片剂制备。

57、优选的，所述的食品中包含上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白，或，通过上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白降解糖胺聚糖的产物。

58、优选的，所述的食品还包含食品领域可接受的辅料。

59、优选的，所述的食品领域可接受的辅料包括载体(例如吸附载体)、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂或防腐剂中的一种或两种以上的组合。

60、本发明所述的食品的种类不受特别限制，可以为任何已知的食品，例如，奶制品、饼干、糕点、饮料、保健品等。

61、优选的，所述食品选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品和悬浮液制品中的至少一种形式。

62、优选的，所述的化妆品中包含上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白，或，通过上述的微生物，或，seq id no：3或与seq id no：3具有80％以上同源性的氨基酸序列，或，包含如seq id no：3所示氨基酸序列的蛋白降解糖胺聚糖的产物。

63、优选的，所述的化妆品中包含化妆品领域可接受的辅料。

64、优选的，所述的化妆品领域可接受的辅料包括溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧化剂、ph调节剂、促渗剂、油脂、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、氨基酸、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂中的一种或两种以上的组合。

65、优选的，所述的化妆品的剂型包括悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、膏体、乳液、粉末、皂体、洗面奶、粉底液(例如粉末粉底液、乳浊液粉底液或蜡粉底液)、面膜、按摩霜或喷雾中的一种或两种以上。

66、本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

67、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

68、本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

69、本发明所述的“小分子透明质酸”是指分子量范围在5kda-50kda之间，优选低于10kda，例如透明质酸寡糖或galnac单糖。

70、本发明的有益效果：

71、本发明从土壤中筛选出一种能够有效降解糖胺聚糖的微生物，在降解糖胺聚糖方面具有催化效率高、稳定性好等优势，还发现所述的微生物能够同时降解多种糖胺聚糖，例如同时降解透明质酸和硫酸软骨素(例如cs-a、cs-c或cs-d中的一种或两种以上)，在农业、临床医疗、食品保健以及化妆品领域具有广阔的应用前景。