一种角质形成细胞功能保护剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于天然医药化学，具体地说，涉及一种角质形成细胞功能保护剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、皮肤屏障是皮肤多种重要生理功能的基础，表皮是皮肤屏障的最外层，对于皮肤屏障功能至关重要，而角质形成细胞又是表皮的组成核心，角质形成细胞不断增殖，分化，迁移形成表皮层，角质形成细胞根据其增殖分化的阶段，可以分为基底层、棘层、颗粒层、角质层。

2、角质层是皮肤的第一道防线，是皮肤的物理性屏障，因其结构特点，被形象地比喻为“砖墙结构”，角质层的渗透功能对皮肤的保湿起着关键的作用。角质层的结构组成可以归纳为三大类：天然保湿因子、细胞间脂质、角质层细胞。细胞间脂质主要随着细胞的生长代谢分散在角质层细胞间，最终随着角质层细胞的崩解，分布至皮肤表面。

3、表皮的棘层会形成一种细胞器：板层小体，板层小体携带多种脂质前体，随着棘层细胞的不断上行、分化，在颗粒层细胞内形成中层板层小体，并逐渐向细胞周边移动，最终与细胞膜融合。细胞移行至角质层后，与细胞膜完全融合的中层板层小体便以胞吐形式排出脂质前体物质和其相关酶进入细胞间隙。一方面细胞继续分化、角化、塌陷，最后形成角质层细胞；另一方面，被排出的脂质前体物质在酶的催化下，生成神经酰胺，脂肪酸和胆固醇等脂质成分。脂质成分不断被挤压，形成复层板层的生物液晶膜结构，于是角质层细胞间脂质便形成了。角质层细胞间脂质不仅具有防止皮肤水分挥发的作用，并且能够粘合角质层细胞，与角质细胞一起构建一层防护墙，减少皮肤水分流失，防止外源性有害物质的入侵。

4、细胞间脂质中的脂肪酸主要为长链脂肪酸，其表达受超长链脂肪酸延伸酶(elongase of very long chain fatty acids,elovl)的调控，elovl1能以c16:0的饱和脂肪酸或c18:1的不饱和脂肪酸为底物进行延伸，生成饱和或不饱和的长链脂肪酸。研究表明，elovl1在形成中枢神经系统的髓磷脂和皮肤屏障作用中起到关键作用，是角质形成细胞维护细胞间脂质平衡的重要因子之一。

5、角质形成细胞易受表面活性剂损伤。表面活性剂进入活性表皮层，对角质形成细胞膜造成破坏，降低角质形成细胞活力，引起大量炎症因子释放，造成皮肤炎症，甚至引起皮肤角质形成基因表达紊乱，比如：分化异常，酶的表达异常等。十二烷基磺酸钠sds，是一种对人体微毒的阴离子表面活性剂，用作乳化剂、去垢剂，去脂能力很强，常添加于洗涤类产品中，直接接触sds或者衣物残留的sds都对皮肤有刺激性。因其过强的清洁能力和高刺激性，长期使用会严重降低皮肤防御能力，导致表皮细胞发育不成熟，影响角质形成细胞的分化和表达。

6、角质形成细胞也易因光、热和紫外线等条件而氧化损伤，导致皮肤自由基过剩。皮肤细胞dna链在自由基的攻击下，易出现结构损伤，致使其表达异常，造成角质形成细胞氧化损伤，其功能弱化，导致其对各类屏障相关的酶系的表达量下降。其中，elovl1的表达下降，可导致角质层细胞脂质无法形成有序结构，进而导致细胞脂质的结构疏松，降低其对角质层细胞的黏合力，最终导致表皮结构松散，无法抵御外界刺激。

7、因此，研发角质形成细胞功能保护剂以对皮肤进行修护十分重要。

8、我国中药文化源远流长，原料药材资源十分丰富。随着近现代生物技术的发展，传统中医药技术与现代生物技术的结合产生了一系列的优秀药物。将二者的结合应用到皮肤外用制剂，研发对角质形成细胞及其功能具有保护作用的皮肤外用制剂，十分必要。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种角质形成细胞功能保护剂。本发明的第二个目的在于提供一种角质形成细胞功能保护剂的制备方法。本发明的第三个目的在于提供上述角质形成细胞功能保护剂在皮肤外用制剂(例如修复sds造成的角质形成细胞损伤和促进细胞elovl1 mrna的表达的药物或促进细胞elovl1 mrna的表达的药物)中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、作为本发明的第一个方面，本发明提供一种角质形成细胞功能保护剂，制备所述保护剂的原料包括原料药材和双孢蘑菇；其中：所述原料药材包括如下质量百分比的组分：15％-40％的野菊花、15％-40％的侧柏叶、15％-40％的苦参和10％-35％的甘草；

4、例如，通过将野菊花提取物、侧柏叶提取物、苦参提取物和甘草提取物，与双孢蘑菇菌丝体提取物混合得到。具体地，制备所述角质形成细胞功能保护剂的方法，包括如下步骤：

5、(1)：按照质量百分比称取所述原料药材，加入原料药材总质量10-20倍的水，于高压提取罐中105℃-115℃高压提取1.5-3h，过滤至澄清，取小于3000da的小分子滤液，得a组分；

6、(2)：取发酵对数生长期的双孢蘑菇菌丝体，加入所述双孢蘑菇菌丝体质量3-5倍的水，经细胞破碎处理，离心取上清脱蛋白后过滤，取小于3000da的小分子滤液部分，浓缩冻干，得b组分；

7、(3)：在所述a组分中加入a组分质量0.01％-1％的b组分，并加水定容至所述原料药材总质量的5-20倍，得到角质形成细胞功能保护剂；或，将所述a组分浓缩冻干，并加入原料药材总质量0.1％-10％的b组分，混合均匀，得到角质形成细胞功能保护剂；

8、或者，将野菊花、侧柏叶、苦参和甘草与双孢蘑菇菌丝体共同发酵后制备角质形成细胞功能保护剂。具体地，制备所述角质形成细胞功能保护剂的方法，包括如下步骤：

9、(a)：按照质量百分比称取所述原料药材，加入原料药材总质量3-5倍的水，灭菌后降至室温；

10、(b)：按每100g原料药材质量接种3-8ml的双孢蘑菇液态菌种，经发酵培养3-10天、补水定容至原料药材总质量的10-20倍、微沸回流提取1.5-3h处理，然后过滤至澄清，取小于3000da的小分子滤液部分，浓缩冻干，得到角质形成细胞功能保护剂；或者，取小于3000da的小分子滤液部分,加水定容至原料药材总质量的5-20倍，得到角质形成细胞功能保护剂。

11、优选地，所述原料药材包括如下质量百分比的组分：20％-35％的野菊花、20％-35％的侧柏叶、20％-35％的苦参和15％-30％的甘草。

12、根据本发明的具体实施例，所述原料药材由如下质量百分比的组分组成：

13、35％的野菊花、25％的侧柏叶、25％的苦参和15％的甘草；

14、20％的野菊花、30％的侧柏叶、30％的苦参和20％的甘草；

15、22％的野菊花、20％的侧柏叶、30％的苦参和28％的甘草。

16、优选地，所述角质形成细胞功能保护剂中还含有适量的防腐剂。本领域技术人员可根据实际需要选择合适的防腐剂种类和含量。

17、在另一些实例中，可在所述a组分中加入适量防腐剂；或，在所述步骤(b)制备的小分子滤液部分中加入适量防腐剂。所述防腐剂可以为1,2-己二醇和对羟基苯乙酮等日化化妆品中可以用于防腐的成分中的至少一种。

18、优选地，所述防腐剂为1,2-己二醇和/或对羟基苯乙酮。所述1,2-己二醇的添加质量为0.5-3％，优选为0.5％；所述对羟基苯乙酮的添加质量为0.1-1％，优选为0.5％。

19、作为本发明的第二个方面，本发明提供一种上述任一项所述的角质形成细胞功能保护剂的制备方法，包括如下步骤：

20、(1)：按照质量百分比称取所述原料药材，加入原料药材总质量10-20倍的水，于高压提取罐中105℃-115℃高压提取1.5-3h，过滤至澄清，取小于3000da的小分子滤液，得a组分；

21、(2)：取发酵对数生长期的双孢蘑菇菌丝体，加入所述双孢蘑菇菌丝体质量3-5倍的水，经细胞破碎处理，离心取上清脱蛋白后过滤，取小于3000da的小分子滤液部分，浓缩冻干，得b组分；

22、(3)：在所述a组分中加入a组分质量0.01％-1％的b组分，并加水定容至所述原料药材总质量的5-20倍，得到角质形成细胞功能保护剂；或，将所述a组分浓缩冻干，并加入原料药材总质量0.1％-10％的b组分，混合均匀，得到角质形成细胞功能保护剂；

23、根据本发明的一个具体实施例，所述步骤(1)中，所述提取时间为2h；所述步骤(1)和(2)中，提取液经过滤至澄清，经2000da的分子截留膜过滤，取小分子滤液部分。

24、在本发明的另一些实例中，所述步骤(3)中，在a组分中分别加入质量为a组分质量0.5％的1,2-己二醇、0.5％的对羟基苯乙酮和1％的b组分，混匀后加水定容至原料药材总质量的10-15倍，得角质形成细胞功能保护剂。

25、在本发明的另一个具体实例中，所述步骤(2)中，所述小分子滤液冻干后得a组分；所述步骤(3)中，在所述a组分中加入0.05％的b组分，混合均匀后得到角质形成细胞功能保护剂。

26、在本发明的另一些实例中，将野菊花、侧柏叶、苦参和甘草与双孢蘑菇菌丝体共同发酵后制备的角质形成细胞功能保护剂。具体地，制备所述角质形成细胞功能保护剂的方法，包括如下步骤：

27、(a)：按照上述质量百分比称取原料药材，加入原料药材总质量3-5倍的水，灭菌后降至室温；

28、(b)：按每100g原料药材质量接种3-8ml的双孢蘑菇液态菌种，经发酵培养3-10天、补水定容至原料药材总质量的10-20倍、微沸回流提取1.5-3h处理，然后过滤至澄清，取小于3000da的小分子滤液部分，浓缩冻干，得到角质形成细胞功能保护剂；或者，取小于3000da的小分子滤液部分,加水定容至原料药材总质量的5-20倍，得到角质形成细胞功能保护剂。

29、优选地，所述步骤(a)中，所述原料药材包括如下质量百分比的组分：20％-35％的野菊花、20％-35％的侧柏叶、20％-35％的苦参和15％-30％的甘草；所述步骤(b)中，所述发酵培养时间为7-9天。

30、在本发明的一个具体实施例中，所述步骤(a)中，加入原料药材总质量约4倍的水；所述步骤(b)中，发酵培养时间为8天，补水定容至原料药材总质量的16倍，并微沸回流提取时间为2h；提取液经过滤至澄清，经2000da的分子截留膜过滤，取小分子滤液部分。

31、根据本发明的一些具体实例，制备所述角质形成细胞功能保护剂的方法，包括如下步骤：

32、(1)精确称取质量百分比22％的野菊花、20％的侧柏叶、30％的苦参、28％的甘草，粗碎后混合均匀；

33、(2)加入原料药材总质量约4倍的水，灭菌后降至室温，按每100g原料药材质量接种5ml或8ml的量接种双孢蘑菇液态菌种，发酵培养8天；

34、(3)加入原料药材总质量约16倍的水，微沸回流提取2h；

35、(4)去除药渣后将液体部分过滤至澄清，经2000da分子截留膜过滤，取小分子滤液部分，浓缩冻干后得角质形成细胞功能保护剂。

36、作为本发明的第三个方面，提供一种上述任一项所述的角质形成细胞功能保护剂，任一项所述的制备方法制备的角质形成细胞功能保护剂在皮肤外用制剂中的应用。

37、优选地，提供一种上述任一项所述的角质形成细胞功能保护剂在制备修复sds造成的角质形成细胞损伤的药物中的应用。

38、优选地，提供一种上述任一项所述的角质形成细胞功能保护剂在促进细胞elovl1mrna的表达的药物中的应用。

39、本发明的角质形成细胞功能保护剂及其制备方法和应用，其有益效果是：

40、本发明的角质形成细胞功能保护剂，以天然植物药材野菊花、侧柏叶、苦参和甘草以及双孢蘑菇为原料，使用现代生物技术方法进行提取制备得到。与野菊花提取物、侧柏叶提取物、苦参提取物和甘草提取物，单独的a组分和b组分等对比例相比，本发明的角质形成细胞功能保护剂能够显著提高对sds造成的角质形成细胞损伤的修复作用，并能有效促进细胞elovl1 mrna的表达，是一种非常有效的皮肤外用制剂。

41、本发明的角质形成细胞功能保护剂的制备方法，通过将野菊花、侧柏叶、苦参和甘草水提取物，和双孢蘑菇菌丝体提取物混合得到，或者将野菊花、侧柏叶、苦参和甘草与双孢蘑菇菌种复合发酵，再经水提取，得到的角质形成细胞功能保护剂均能够显著提高对sds造成的角质形成细胞损伤的修复作用，并能有效促进elovl1 mrna的表达。其中采用后一方法提取的效果更佳。