一种DNA纳米机器及其制备方法和应用

本技术涉及生物医药，尤其是一种dna纳米机器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(gbm)是成人中枢神经系统最常见和最致命的原发性恶性肿瘤，预后不佳，中位生存率约为15个月。包括手术切除、放疗和化疗在内的传统治疗方法在改善gbm患者预后方面疗效有限。这种限制主要归因于几个因素。首先，gbm具有弥漫性浸润性，具有侵袭性生长模式和边界不清的特点，为精确有效的肿瘤切除带来了挑战。此外，血脑屏障(bbb)是一个巨大的障碍，阻碍了大多数药物血液的渗透进入中枢神经系统。因此，目前的临床实践严重依赖替莫唑胺(tmz)作为gbm的单药治疗，而对tmz的耐药性的发展进一步影响了化疗的疗效。此外，gbm肿瘤的严重缺氧微环境和深部脑内位置明显限制了放疗的有效性。因此，探索创新的治疗策略以改善gbm患者的治疗效果势在必行。

2、近年来，化学动力疗法(cdt)因其显著的时空选择性、最小的侵袭性以及通过产生活性氧(ros)诱导细胞死亡的能力，在治疗各种恶性肿瘤领域受到了广泛关注。与其他动态疗法(包括光动力疗法、声动力疗法和电动力疗法)不同，cdt不依赖于外部刺激(如光、声和电)，也不依赖于持续的氧气供应。cdt的这些独特特征使其能够克服与穿透深度和缺氧微环境相关的挑战，使其成为治疗gbm的一种有前景的方法。这种治疗方式利用过渡金属离子，如亚铁离子(fe2+)、锰离子(mn2+)和铜离子(cu2+)作为催化剂，通过芬顿或类芬顿反应将内源性过氧化氢(h2o2)转化为羟基自由基(·oh)。其中cu2+基fenton-like反应有报道在中性条件和弱酸性肿瘤微环境(tme)下均可发生。相比之下，大多数其他过渡金属离子(如fe2+)催化芬顿或类芬顿反应依赖于强酸性条件(ph 2-4)。此外，cu2+基类芬顿反应速率可达1×104m-1s-1，比fe2+基类芬顿反应速率高约160倍。综上所述，cu2+是一种理想的高效cdt试剂。然而，在cdt广泛应用于gbm治疗之前，需要解决的一个重要障碍是cdt药物穿过血脑屏障的渗透有限，并且它们在肿瘤部位的积累不足，这可能会影响cdt治疗gbm的疗效。因此，探索合适的策略和载体来促进cdt剂穿透血脑屏障并增强其对肿瘤细胞的靶向性是至关重要的。

3、随着dna纳米技术的快速发展，基于dna框架的核酸纳米结构被设计和合成。其中，四面体框架核酸(tfnas)已成为具有广泛生物医学应用前景的药物传递载体。与其他纳米载体相比，tfnas具有明显的优势。值得注意的是，它们具有高度可编程性，允许各种药物的精确组装或与功能单位(如抗体，靶向肽和核酸适体)进行修饰。这一特性有望增强它们穿透血脑屏障并特异性靶向肿瘤细胞的能力。此外，tfnas表现出优异的生物相容性、低免疫原性、最小毒性和高安全性。因此，应用tfna作为cdt药物的纳米载体，有可能对gbm产生强有力的治疗效果。然而，据现有技术所知，这一研究领域在很大程度上仍未被探索。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种dna纳米机器及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种dna纳米机器，所述dna纳米机器至少包括具有dna适配体的四面体框架核酸，铜离子负载至四面体框架核酸上；

4、所述四面体框架核酸由seq id no:1～seq id no:4的寡核苷酸序列组成。

5、化学动力疗法(cdt)在多种恶性肿瘤中显示出良好的抗肿瘤效果。然而，它在胶质母细胞瘤(gbm)中的应用受到cdt药物跨越血脑屏障(bbb)和实现有效肿瘤靶向的挑战的显著阻碍。为了克服这些障碍，本研究提出了一种新的dna纳米机器(cu@tfnas-g-a nm)，通过将铜离子(cu2+)装载到具有dna适配体的四面体框架核酸(tfnas)上，制备的dna纳米机器具有有效穿透血脑屏障并选择性地在肿瘤细胞中积累的能力，内化后，负载cu2+与肿瘤过表达的还原性谷胱甘肽(gsh)和过氧化氢(h2o2)发生反应，产生羟基自由基(·oh)，诱导肿瘤细胞死亡。此外，cu@tfnas-g-a纳米被发现能在24小时内迅速从大脑和正常组织中清除，最大限度地减少潜在的全身毒副作用。这些发现表明cu@tfnas-g-a nm具有有效cdt治疗gbm的潜力，并为gbm靶向治疗的发展开辟了新的途径。

6、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，所述dna适配体包括血脑屏障穿透肽和/或肿瘤靶向肽；

7、所述血脑屏障穿透肽包括gs24 dna适配体；

8、所述肿瘤靶向肽包括as1411 dna适配体。

9、本技术采用的血脑屏障穿透肽用于血脑屏障穿透，采用的肿瘤靶向肽用于肿瘤靶向，具体为，gs24 dna适配体用于血脑屏障穿透，as1411 dna适配体用于肿瘤靶向，使得cu@tfnas-g-a nm具有有效穿透血脑屏障并选择性地在肿瘤细胞中积累的能力。

10、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，所述血脑屏障穿透肽偶联至seqid no:3的5'端；所述肿瘤靶向肽偶联至seq id no:2的5'端。

11、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，dna适配体为gs24 dna适配体，所述具有dna适配体的四面体框架核酸由seq id no:1～seq id no:2、seq id no:4～seq idno:5的寡核苷酸序列组成。

12、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，所述dna适配体为gs24dna适配体和as1411 dna适配体，所述具有dna适配体的四面体框架核酸由seq id no:1、seq id no:4～seq id no:6的寡核苷酸序列组成。

13、在本技术的技术方案中，本技术精心设计了一个dna纳米机器(缩写为cu@tfnas-g-a nm)，通过将cu2+加载到双dna适配体修饰的tfna上，为gbm提供强大的cdt治疗。

14、一方面，gs24 dna适配体对小鼠脑血管内皮细胞上的转铁蛋白受体(trf)具有很强的亲和力，促进cu@tfnas-g-a nm通过血脑屏障。

15、另一方面，as1411 dna适配体与核蛋白结合，核蛋白在许多恶性肿瘤细胞中过表达，从而增强cu@tfnas-g-a nm的肿瘤靶向能力。成像结果显示cu@tfnas-g-a纳米成功通过血脑屏障并在肿瘤细胞中积累。随后，cu@tfnas-g-anm中负载的cu2+与肿瘤过表达的还原性谷胱甘肽(gsh)和h2o2反应，导致大量·oh的快速生成，最终导致细胞死亡；此外，cu@tfnas-g-a纳米被发现在24小时内有效地从大脑和正常组织中清除，大大减少了安全问题。总的来说，本技术的研究提出了一种安全而有希望的治疗gbm的方法。

16、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，所述dna纳米机器还包括fret供体和fret受体，所述fret供体和fret受体标记四面体框架核酸。

17、作为本技术所述dna纳米机器的优选实施方式，所述fret供体包括cy3，所述fret受体包括cy5。

18、本技术还提供了一种所述的dna纳米机器的制备方法，包括以下步骤：

19、1)将seq id no:1～seq id no:4的寡核苷酸序列，或者，将seq id no:1～seq idno:2、seq id no:4～seq id no:5的寡核苷酸序列，或者，将seq id no:1、seq id no:4～seq id no:6的寡核苷酸序列在缓冲液中合成形成混合物；

20、2)将混合物加热，然后进行pcr反应，然后再加入cucl2·2h2o混合，室温孵育，离心，得到dna纳米机器。

21、本技术还提供了一种cdt药物，所述cdt药物包括所述的dna纳米机器。

22、经过本技术实验可知，cu@tfnas-g-a nm有效地促进·oh的产生，导致线粒体膜电位氧化和随后的细胞死亡，突出了cu@tfnas-g-a nm作为一种有前途的cdt药物候选癌症治疗的潜力。

23、本技术还提供了dna纳米机器驱动化学动力疗法在制备治疗胶质母细胞瘤产品中的应用。

24、本技术的dna纳米机器可以驱动cdt对胶质母细胞瘤的体外、体内抗癌。

25、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

26、本技术提供了一种dna纳米机器及其制备方法和应用，本技术通过将铜离子(cu2+)装载到具有dna适配体的四面体框架核酸(tfnas)上，制备的dna纳米机器具有有效穿透血脑屏障并选择性地在肿瘤细胞中积累的能力，内化后，负载cu2+与肿瘤过表达的还原性谷胱甘肽(gsh)和过氧化氢(h2o2)发生反应，产生羟基自由基(·oh)，诱导肿瘤细胞死亡。此外，cu@tfnas-g-a nm被发现能在24小时内迅速从大脑和正常组织中清除，最大限度地减少潜在的全身毒副作用。这些发现表明cu@tfnas-g-a nm具有有效cdt治疗gbm的潜力，并为gbm靶向治疗的发展开辟了新的途径。