一种SIRT1基因修饰BMSCs的水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料

本发明属于生物医学，具体涉及一种sirt1基因修饰bmscs的水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料。

背景技术：

1、软骨缺损是由创伤、免疫异常、炎症等引起，造成软骨缺失、退变的一种常见病变，其中以关节软骨缺损为主。由于缺乏血管、神经，并与循环系统分离，使得软骨自我修复能力差，大面积的软骨缺损(＞4mm)无法自我修复，此类疾病治疗不及时，会导致对应关节面软骨损伤及邻近组织退变，软骨组织的合成和分解代谢紊乱，严重者引发骨关节炎(osteoarthritis,oa)，从而给患者本人、患者家庭及国家带来沉重负担。由支架材料、种子细胞、生物活性物质三要素有机结合的组织工程材料能够有效修复关节软骨缺损。

2、目前最佳的治疗方法是软骨缺损的手术修复，比如通过软骨细胞、软骨、骨膜移植等方法进行，虽取得一定疗效，但限于移植物来源、免疫排斥及手术复杂等问题，再加上修复过程中移植物与自身软骨组织不能很好的整合，移植物在修复过程中无法与受损软骨及软骨下骨形成统一整体，使治疗效果不佳。近年来，人工软骨支架材料修复软骨缺损在骨科中的应用越来越广泛，并因其良好的性能备受关注。人工软骨支架材料主要由各种材料构成，并可以复合种子细胞和生物活性物质。支架材料分为金属和非金属材料，前者包括镁合金、钛合金、钴铬合金等，后者包括聚乳酸、聚乙醇酸、明胶等。种子细胞同样来源广泛，如骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,bmscs)、脂肪间充质干细胞、软骨细胞等。而生物活性物质也多种多样，包括基因、蛋白质、药物等。当支架材料、种子细胞和生物活性物质三要素共同形成人工软骨支架材料复合体起作用时，能更好的发挥三者作用，并通过人工软骨支架材料与受损软骨进行整体整合，更好的修复软骨缺损。

3、镁合金材料的生物学特性及独特优势：镁合金是一种研究广泛的新材料，已在临床领域使用并取得良好效果。相较钴铬合金、钛合金等难降解、机体内不存在、与骨骼密度差异大且开发价格高的合金相比，镁合金具有以下优势：(1)镁合金具有良好的生物可降解性：镁合金电极电位低，可在关节液、血液等环境中发生化学反应降解成镁离子和氢气等，而镁离子具有促成软骨、骨、血管作用，氢气能够抗炎、抗氧化，产物均有利于形成软骨缺损修复的正向环境；加之镁合金可通过添加不同比例的锌、钕、锆等无害金属控制其降解性，能使镁合金的降解与新生软骨的形成相对等。(2)镁合金具有较高的生物安全性：镁离子是人体所需的常量元素，在细胞中，镁离子主要浓集于线粒体，是细胞中仅次于钠和磷的阳离子；在组织中，镁离子主要存在于骨和牙齿，并存在于心、肝、肌肉等器官，含量仅次于钙、钾、钠，参与了机体几乎全部的重要能量代谢和新陈代谢。(3)镁合金具有较强的生物相容性：镁密度是1.74g/cm3，弹性模量为40gpa，与人骨骼密度1.8-2.0g/cm3及弹性模量3-20gpa最接近，在软骨缺损过程中，软骨下骨也会损伤，镁合金通过与骨组织接近的密度及弹性模量可减少“应力遮挡”效应，有利于软骨下骨修复，从而又为软骨缺损修复提供便利条件，使得软骨缺损自下而上形成整体修复。(4)镁合金具有较低合成成本：地球镁存量大，随着科技发展，其合成提纯成本降低，远低于其他医用合金，更有利于镁合金的商品化。

4、水凝胶的生物学特性及独特优势：明胶是从动物胶原含量丰富的组织中，经过一系列的理化作用而形成的一种分子质量大小不等的多肽混合物，可以分为等电点较高的a型明胶和等电点较低的b型明胶，两种类型的明胶均具有较好的生物可降解性和相容性。此外，明胶还能够抗菌、抗氧化，其免疫原性也很低，在生物体内可以随着时间的推移而被完全吸收。用明胶制成的生物支架有利于细胞的黏附、增殖和分化，细胞可以更好的在其表面生长，形成具有生物功能的复合体。以明胶为基础材料的水凝胶有利于软骨缺损修复，与镁合金材料搭配后能够完成由软骨下骨到软骨的整个缺损的修复。

5、bmscs的生物学特性及独特优势：bmscs作为中胚层干细胞，具有多分化潜能，能自我更新，对周围细胞起支持作用，可以分泌白介素、集落刺激因子等，在适宜条件下可以分化成软骨细胞、成骨细胞等。bmscs来源广泛、免疫原性低、取材方便、便于培养，是组织工程研究领域最为理想的种子细胞。因而在临床领域应用广泛，被用来治疗软骨缺损、股骨头坏死等，取得了良好效果。

6、沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,sirt1)基因的生物学特性：sirt1基因是具有高度保守核心序列的iii型去乙酰化酶基因，在哺乳动物中研究较多。该基因可通过通路中相关因子的表达调控机体衰老、影响能量代谢、控制细胞周期、调节激素分泌、保护神经组织及预防病毒感染等。该基因位于人10号染色体，其编码的蛋白质由500个氨基酸残基构成，分子量120kda，主要位于细胞核，在翻译后水平调节各种蛋白质的作用及功能。sirt1基因可以被漆树黄酮、白藜芦醇等激活，引起sirt1蛋白上调，其可通过靶分子的作用参与细胞内dna损伤修复、机体新陈代谢，并通过抑制细胞凋亡、维持线粒体功能及抑制炎症等调控机体的功能。

7、关节疾病导致的软骨缺损是临床治疗难点，为解决上述问题，现提出一种sirt1基因修饰bmscs/水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料，从而为临床治疗软骨缺损提供新思路。需要说明的是，上述内容属于发明人的技术认知范畴，并不必然构成现有技术。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种sirt1基因修饰bmscs的水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料，包括具有水凝胶涂层的多孔镁合金，所述多孔镁合金上负载有sirt1基因过表达的bmscs。

4、一种水凝胶涂层多孔镁合金新型复合材料的制备方法，包括以下步骤：

5、首先构建sirt1基因过表达慢病毒载体并包装成可感染大鼠原代bmscs的慢病毒，用其感染bmscs后稳定过表达细胞中sirt1基因；

6、取冻干后的水凝胶溶于浸入sirt1基因过表达的bmscs的悬液，并将其注射于制备好的多孔镁合金材料表面。

7、进一步的，所述多孔镁合金材料具体为采用热压烧结制得的多孔支架。

8、进一步的，所述水凝胶的制备方法为：将明胶加入去离子水中得到溶液1，同时将没食子酸溶于去离子水和二甲基甲酰胺的混合液中，待完全溶解后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，搅拌得到溶液2，然后将溶液2加入溶液1中透析得到混合物。

9、进一步的，所述冻干后的水凝胶具体制备方法为，将透析得到混合物冰冻后，再放入冻干机。

10、所述制备方法在制备软骨修复药物上的应用。

11、一种膝关节软骨缺损和修复模型的构建，包括以下步骤：

12、将大鼠麻醉后，暴露大鼠膝关节，在大鼠膝关节股骨髁非负重区构建圆柱形软骨缺损，并在软骨缺损处植入修复材料。

13、所述模型在制备或筛选软骨修复药物上的应用。

14、本发明的有益效果：

15、现有的软骨缺损修复的商品化材料多为单一成分的材料，只能针对软骨层进行修复，而软骨缺损本身存在软骨层和软骨下层的缺损，在本发明中多孔镁合金材料有利于软骨下骨缺损的修复，而水凝胶涂层有利于软骨层修复，从而形成从下而上的整体修复效果，加上材料本身存在孔隙，有利于负载的bmscs及新生的bmscs和新生血管攀附，并且材料的降解速度与新生组织的形成能够相互适应，再加之s irt1基因对bmscs进行调控，过表达sirt1后可以促进bmscs在软骨生成的微环境中向软骨细胞分化，形成良性循环，为临床治疗软骨缺损提供了新的方案和策略。