基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原肿瘤纳米疫苗及其制备方法与流程

：本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原肿瘤纳米疫苗及其制备方法，可用于癌症治疗，属于生物与新医药。

背景技术

0、背景技术：

1、近年来，蓬勃发展的免疫疗法为肿瘤治疗带来了巨大变革。肿瘤疫苗作为免疫治疗的重要策略之一，可刺激机体产生针对靶抗原的特异性免疫反应从而调变免疫微环境、引发抗肿瘤效应。然而，目前肿瘤疫苗的形式主要为多肽、rna、dna等，体内稳定性差，容易降解。此外，单纯的肿瘤抗原缺乏淋巴结靶向性，难以被有效投递到能够产生免疫应答的次级淋巴器官。

2、使用纳米载体投递肿瘤抗原、构建纳米化肿瘤疫苗，可有效保护抗原过早降解，并能在一定程度上增强抗原递呈细胞对肿瘤疫苗的摄取。尽管新型纳米制剂不断涌现，但如何设计出具有强烈免疫激活作用的肿瘤纳米疫苗依然是当前面临的挑战。噬菌体是专一感染细菌的病毒，在人体和动物体内均广泛存在。噬菌体具有以下特点：①噬菌体是天然的纳米颗粒。工程化噬菌体可作为纳米载体投递抗肿瘤药物、肿瘤显像剂等，并展现出良好的生物安全性；②噬菌体繁殖迅速，可快速、大量生产，制备方便、成本较低。其宿主是易于培养、生长周期短的细菌，无需细胞培养，比一般蛋白疫苗更易于制备、纯化；③噬菌体基因组结构简单、易于遗传操作。噬菌体基因组可耐受外源性蛋白基因序列的插入，并能将外源性蛋白展示于噬菌体表面而不影响其空间结构和生物活性，在此基础上发展出的噬菌体展示技术已在抗体药物研发和肿瘤靶向治疗领域得到广泛应用；④噬菌体可有效激活先天免疫系统和适应性免疫系统，是天然的免疫佐剂。噬菌体中的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,pamps)可与免疫细胞中的模式识别受体(patternrecognition receptors,prrs)结合，从而引起免疫细胞的广泛激活。噬菌体基因组中尤其富含cpg核苷酸序列，可通过tlr9相关信号通路强烈活化apcs。携带外源性抗原的噬菌体可促进apcs对抗原的加工、递呈，并引发抗原特异性免疫反应。因此，噬菌体作为一种纳米级生物载体，在肿瘤疫苗领域具有强大的应用潜力。

3、通过靶向抗原递呈细胞，尤其是树突状细胞(dendritic cells,dcs)的特异性标志物递送肿瘤疫苗，可进一步增强抗原递呈细胞对肿瘤抗原的摄取，从而产生更强的抗肿瘤免疫效应。常见的dc靶点包括dec-205、甘露糖受体(mannose receptor,mr)和cd40等。其中，cd40在未成熟dc表面即有较高水平表达，且未成熟dc主要负责摄取、加工处理和递呈抗原；dc成熟后，迁移能力增强，cd40表达水平进一步升高。实验证明，靶向cd40投递的肿瘤疫苗被交叉递呈的效率最高，活化抗原特异性cd8+t细胞的效果最好(blood,2012,120(10):2011-20)。此外，cd40作为一种共刺激分子，可通过多聚化激活下游信号通路。cd40激动剂能有效增强抗原递呈、促进dc成熟及功能活化，并被证实可与多种tlr激动剂协同作用，进一步强化肿瘤疫苗的免疫应答。

4、综上所述，以噬菌体作为抗原肽载体，以cd40作为靶点制备新型生物纳米疫苗，可将肿瘤抗原与免疫佐剂同步精准递送至抗原递呈细胞，有利于提高肿瘤抗原的递呈，增强肿瘤特异性免疫反应，同时成本低、生产周期短、安全性高，是一种极富前景的疫苗开发方向。

技术实现思路

0、技术实现要素：

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原肿瘤纳米疫苗及其制备方法，以m13噬菌体作为载体，通过基因工程技术使其展示cd40特异性靶向结合蛋白，通过化学修饰的方法使其负载肿瘤新抗原肽，从而构建以噬菌体为核心的多功能肿瘤纳米疫苗，实现对抗原递呈细胞的精准靶向，增强肿瘤抗原的摄取、递呈，提高肿瘤特异性免疫反应，促进机体的抗肿瘤杀伤。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、(一)本发明提供一种基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原肿瘤纳米疫苗的制备方法，将cd40靶向结合蛋白的基因序列克隆入m13噬菌体载体，使cd40靶向结合蛋白呈现于m13噬菌体piii蛋白的n末端，得到表面展示cd40靶向结合蛋白的m13重组噬菌体载体，使其获得对抗原递呈细胞的主动靶向能力；通过nhs/edc化学交联反应将肿瘤新抗原多肽修饰于cd40靶向的m13重组噬菌体pviii蛋白上，得到基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原纳米疫苗。

4、进一步的，本发明方法包括以下步骤：

5、s1、克隆cd40靶向结合蛋白的核苷酸序列，插入m13噬菌体载体，得到m13重组噬菌体载体；

6、s2、将肿瘤新抗原多肽、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(n-(3-dimethylaminopropyl)-n′-ethylcarbodiimide,edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysulfosuccinimide，nhs)混合，调节ph＝5～6，得到羧基活化的肿瘤新抗原多肽；

7、s3、将m13重组噬菌体载体与羧基活化的肿瘤新抗原多肽混合，调节ph＝7～8，使肿瘤新抗原多肽活化的羧基与m13重组噬菌体载体pviii表面的氨基形成酰胺键，实现肿瘤新抗原多肽与m13重组噬菌体载体的连接；

8、s4、将s3合成后的溶液转移至14kda透析袋，pbs透析48h，去除多余的肿瘤新抗原多肽、nhs和edc试剂，纯化得到基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性新抗原纳米疫苗。

9、进一步的，所述cd40靶向结合蛋白的氨基酸序列为seq id no:1，具体为：

10、dlgkklleaaragqddevrilmangapftqdwsgwtplhlaarrghleivevllkygadvnavdkcgatplhlaawsghleivevllkygadvnakdgigptplhlaavtghleivevllkygadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq。

11、进一步的，所克隆的cd40靶向结合蛋白的核苷酸序列为seq id no:2，具体为：

12、gacctgggcaagaagctgctggaggccgccagggccggccaggacgacgaggtgaggatcctgatggccaacggcgcccccttcacccaggactggagcggctggacccccctgcacctggccgccaggaggggccacctggagatcgtggaggtgctgctgaagtacggcgccgacgtgaacgccgtggacaagtgcggcgccacccccctgcacctggccgcctggagcggccacctggagatcgtggaggtgctgctgaagtacggcgccgacgtgaacgccaaggacggcatcggccccacccccctgcacctggccgccgtgaccggccacctggagatcgtggaggtgctgctgaagtacggcgccgacgtgaacgcccaggacaagttcggcaagaccgccttcgacatcagcatcgacaacggcaacgaggacctggccgagatcctgcag。

13、进一步的，所述肿瘤新抗原多肽为任意肿瘤新抗原肽。

14、进一步的，所述肿瘤新抗原多肽为小鼠恶性黑色素瘤新抗原肽m27(lcpgnkyem)、小鼠结肠癌新抗原肽e2f8(ilpqapsgpsyatylqpaqaqmltp)、人kras新抗原肽kras g12v(klvvvgavgvgksalti)、kras g13d(klvvvgagdvgksalti)或者人braf新抗原肽braf v600e(lhedltvkigdfgalteksrwsgshqfeqls)。

15、进一步的，所述s2中，肿瘤新抗原多肽、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1:2:4混合。

16、进一步的，所述s3中，m13重组噬菌体载体与羧基活化的肿瘤新抗原多肽按照摩尔比1:10000混合。

17、(二)本发明还提供一种基于噬菌体载体的树突状细胞靶向性肿瘤新抗原纳米疫苗，根据以上所述的制备方法制备而成。

18、本发明的有益效果：

19、1)本发明的噬菌体疫苗自身具有免疫原性，可有效激活先天免疫系统和适应性免疫系统，激发机体的抗肿瘤免疫反应；

20、2)本发明通过基因工程技术，使噬菌体表面展示cd40靶向结合蛋白，从而实现对抗原递呈细胞的精准靶向，可促进抗原递呈细胞对肿瘤抗原的吞噬、递呈，有效增强t细胞的肿瘤特异性杀伤；

21、3)本发明选择化学修饰而非基因改造的方法将抗原肽负载于噬菌体表面，有利于降低双重展示的噬菌体纳米疫苗的构建难度和成本，并增强其普适性，可以方便的针对不同抗原肽构建相应的多功能噬菌体纳米疫苗；

22、4)本发明的噬菌体疫苗易于培养、生长周期短、成本低、易于制备纯化；

23、5)本发明的噬菌体疫苗安全性高，未发现不良反应。