HDAC5和S100A13作为骨关节炎的诊治靶标

本发明涉及医药生物，具体地说，是关于hdac5和s100a13作为骨关节炎的诊治靶标。

背景技术：

1、骨关节炎(osteoarthritis，oa)亦称为骨关节病、退行性关节炎、增生性关节炎、老年性关节炎，是一种病因尚不明确的以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病。好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及远侧指间关节等部位。临床上表现为进展性关节疼痛，可有晨僵、关节肿大等。

2、软骨细胞代谢失衡和衰老是oa(骨关节炎)发生的重要因素，但其生物学机制目前还不明确，hdac5参与调控多种生物学功能，但hdac5在oa发生过程中的作用还未知。sox9是调控软骨细胞合成代谢最关键性的转录因子，表观遗传学修饰对转录因子的功能具有很重要的影响。软骨下骨硬化是oa发生后期的标志性表现，然而oa发生过程中软骨下骨免疫微环境的变化还不清楚。针对骨性关节炎，目前临床上缺乏有效的干预手段。

3、中国专利文献cn105132574a，公开了一种用于骨关节炎早期诊断的分子标志物-slc5a8基因及其表达产物。本发明利用基因芯片和蛋白免疫方法证明在骨关节炎患者的滑膜组织中slc5a8基因的mrna表达水平和蛋白质表达水平显著低于正常滑膜组织。根据slc5a8基因与骨关节炎的相关性，本发明公开了一种可用于诊断骨关节炎的试剂盒，该试剂盒可以测定slc5a8基因的表达水平，由于该试剂盒可以在骨关节的早期即可诊断，所以在临床上具有广泛的应用前景。中国专利文献cn105154540a，公开了一种用于骨关节炎早期诊断的分子标志物-paep基因。实验证明，在骨关节炎患者滑膜组织中的paep基因的mrna水平显著低于正常滑膜组织，因此通过测定受试者滑膜组织中paep基因的表达水平可以判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险，或者可以判断受试者是否已经患有骨关节炎。paep基因可以用于制备施用于骨关节炎患者或者施用于患骨关节炎风险高的人群，以用于治疗骨关节炎或预防骨关节炎的发生。本发明为临床上诊断骨关节炎提供了新的诊断方法并且为治疗骨关节炎提供了新的候选药物。

4、而目前关于hdac5和s100a13(s100钙结合蛋白a13)作为oa治疗靶标，还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供hdac5和s100a13作为骨关节炎的诊治靶标。

2、第一方面，本发明提供了hdac5和/或hdac5表达促进剂在制备骨关节炎药物中的应用。

3、作为一个优选例，所述促进剂选自小分子化合物或生物大分子。

4、第二方面，本发明提供了检测hdac5含量的试剂在制备骨关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。

5、第三方面，本发明提供了s100a13和/或s100a13表达抑制剂在制备骨关节炎药物中的应用。

6、作为一个优选例，所述抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。

7、第四方面，本发明提供了检测s100a13含量的试剂在制备骨关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。

8、本发明中：解决的技术问题

9、(1)软骨细胞代谢失衡和衰老是oa(骨关节炎)发生的重要因素，但其生物学机制目前还不明确，hdac5参与调控多种生物学功能，但hdac5在oa发生过程中的作用还未知。本项研究将阐明hdac5调控软骨细胞代谢和oa发生的作用机制。

10、(2)sox9是调控软骨细胞合成代谢最关键性的转录因子，表观遗传学修饰对转录因子的功能具有很重要的影响，在本项研究中我们将阐明乙酰化修饰对sox9细胞核转位和转录活性的影响。

11、(3)软骨下骨硬化是oa发生后期的标志性表现，然而oa发生过程中软骨下骨免疫微环境的变化还不清楚，我们利用单细胞技术分析了软骨下骨免疫微环境中免疫细胞的变化。

12、(4)针对骨性关节炎，目前临床上缺乏有效的干预手段，本项研究将阐明hdac5和s100a13(s100钙结合蛋白a13)作为oa治疗靶标的可行性。

13、本发明中：研究内容

14、(1)hdac5调控软骨细胞代谢和oa发生的功能研究

15、分离人和小鼠原代软骨细胞，检测炎症因子刺激下hdac5的表达以及在细胞中的定位情况；分离人膝关节以及髋关节关节软骨退变磨损区和非磨损区，检测hdac5的表达；在人和小鼠软骨细胞中调控hdac5的表达检测软骨细胞分解和合成代谢相关基因的表达；利用hdac5敲基因小鼠构建创伤性关节炎模型和老年性小鼠关节炎模型，进行番红o-快绿染色以及免疫荧光染色检测oa的进展，构建dmm小鼠关节炎模型，通过关节腔注射hdac5激动剂或者过表达慢病毒，进行组织切片染色检测oa的进展；

16、(2)hdac5调控sox9乙酰化修饰促进软骨细胞合成代谢的机制研究

17、在软骨细胞中调控hdac5的表达，利用western blot和免疫荧光检测sox9的表达以及在细胞质和细胞核中的定位情况，利用co-ip检测hdac5和sox9的结合以及sox9乙酰化水平的变化，构建荧光素酶报告基因检测hdac5对sox9转录活性的影响；构建sox9乙酰化位点突变软骨细胞系和小鼠，利用western blot和qpcr检测sox9乙酰化位点突变后对软骨细胞合成代谢的影响，利用免疫荧光检测sox9乙酰化位点突变后在细胞质和细胞质中的定位情况；构建荧光素酶报告基因检测sox9乙酰化位点突变对sox9转录活性的影响。

18、(3)hdac5/klf2/s100a13信号通路调控软骨细胞衰老和分解代谢机制研究

19、分离原代软骨细胞，利用炎症因子刺激，检测klf2和s100a13的表达；构建原代软骨传代细胞衰老模型，检测hdac5、klf2和s100a13的表达；在软骨细胞中调控hdac5的表达检测klf2和s100a13的表达，检测软骨细胞的衰老；在软骨细胞中调控klf2的表达，检测s100a13的表达，检测软骨细胞的衰老；利用co-ip检测hdac5和klf2的结合，在软骨细胞中敲除klf2后检测hdac5对s100a13的表达变化；克隆s100a13的启动子序列，构建荧光素酶报告基因载体，检测klf2对s100a13的转录调控作用；构建dmm小鼠关节炎模型，通过关节腔注射s100a13中和抗体或者敲低慢病毒，进行组织切片染色检测oa的进展；

20、(4)hdac5/mtor信号通路调控b细胞分化介导软骨下骨硬化的机制研究

21、根据单细胞测序数据分析hdac5敲除后不同b细胞亚群的分类和比例；利用流式细胞仪检测hdac5敲除小鼠软骨下骨骨髓微环境中opg+和rankl+细胞的比例；在b细胞中调控hdac5的表达，检测opg和rankl的表达，检测mtor信号通路的活性；分离b细胞中利用mtor信号通路抑制剂或者激活剂调控mtor信号通路，检测b细胞中opg和rankl的表达；构建小鼠dmm模型，关节腔中给予hdac5激动剂或mtor信号通路激动剂，检测opg+和rankl+b细胞的比例，检测软骨下骨硬化情况以及成骨细胞和破骨细胞活性。

22、本发明优点在于：本发明阐明hdac5调控软骨细胞代谢和oa发生的作用机制。在本发明中阐明乙酰化修饰对sox9细胞核转位和转录活性的影响。本发明利用单细胞技术分析了软骨下骨免疫微环境中免疫细胞的变化。本发明阐明hdac5和s100a13作为oa治疗靶标的可行性。camk2d通过磷酸化hdac5激活hdac5的活性，hdac5与sox9结合降低sox9的乙酰化水平，从而促进sox9的入核和并增强其转录活性促进软骨细胞的合成代谢；hdac5与klf2结合保持klf2对s100a13的转录抑制，减缓软骨细胞的衰老并抑制软骨细胞分解代谢；hdac5维持软骨下骨免疫微环境中b细胞的正常发育，进而维持骨形成和骨吸收的动态平衡。本发明从关节软骨细胞和软骨下骨免疫微环境两个方面全面阐述了hdac5在oa中的调控作用。