一种脐带动脉旁干细胞来源外泌体微球、注射液及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，一种脐带动脉旁干细胞来源外泌体微球、注射液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、卵巢功能衰退引起的低雌激素水平和生育能力丧失是妇女生殖健康的两大威胁。目前研究表明有效的治疗方式包括激素替代，透明质酸，生长激素，褪黑素，免疫调节治疗，卵巢组织冷冻，体外激活技术，中医中药和干细胞治疗等。补充性激素是目前最主要的治疗方法，可以有效缓解患者的围绝经期症状，但无法改善卵巢功能，产生高潜能卵子。

2、目前，干细胞修复卵巢功能具有良好的前景，但仍有不足。主要包括：(1)目前临床应用的主要是脐带华通氏胶间充质干细胞或脐带干细胞混合物，特征不明确，组织修复能力不明显。(2)干细胞治疗存在免疫性问题。(3)组织血管的再生起到重要作用，但一般的无细胞体系-干细胞来源外泌体治疗效果仍有待提高。

技术实现思路

1、为解决上述一般干细胞来源外泌体修复卵巢效率低、治疗效果不稳定等缺点问题，本发明公开了一种脐带动脉旁干细胞来源外泌体微球、注射液及其制备方法和应用。负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体由甲基丙烯酰化透明质酸(hama)包裹制成微球。本发明将组织修复作用与药物缓释系统相结合，运用微流控电喷技术，获得相对于外泌体直接注射更为可控和持续的疗效。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，由以下步骤制备：

4、将脐带动脉旁干细胞来源外泌体均匀混合于hama溶液，将混合了外泌体的hama溶液置于电喷装置的相应注射器中，通过电喷技术，在高压电的作用下将混合溶液喷射到硅油中，喷射路径经紫外光照射，获得包裹外泌体的固化微球。

5、进一步的，上述一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，所述hama溶液由以下步骤制备：

6、称取hama固体，加入到含有光引发剂的pbs中分散，充分溶解。

7、进一步的，上述一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，所述脐带动脉旁干细胞来源外泌体来自于新生儿脐带。

8、进一步的，上述一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，所述脐带动脉旁干细胞来源外泌体由以下步骤制备：

9、脐带动脉培养后衍生出动脉旁干细胞，培养基中加入脂多糖(lps)刺激，获得培养上清，培养上清经过超速离心等步骤后，获得脐带动脉旁干细胞来源外泌体，这些外泌体富含ccn1和lgmn等促血管生成蛋白。

10、进一步的，上述一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，所述微球平均直径为200μm左右。

11、进一步的，上述一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，电喷中的参数如下：流速为200μm/s，高压直流电5kv，接收距离为8～10cm，毛细玻璃管直径为100μm，加入正己烷清除硅油，正己烷挥发后，用含2％双抗pbs重悬微球。

12、本发明还公开了上述可注射微球在制备治疗或改善缺血性卵巢早衰的药物中的用途。

13、本发明还公开了一种治疗或改善缺血性卵巢早衰的注射液，所述注射液中含有上述的可注射微球。

14、进一步的，上述一种治疗或改善缺血性卵巢早衰的注射液，所述可注射微球溶解于pbs中。

15、本发明具有以下有益效果：

16、(1)本发明以微流控电喷为技术基础，结合生物材料的性质，制备出负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，在卵巢组织中缓释释放后修复卵巢。

17、(2)该载外泌体的微球制备工艺流程易操作，无昂贵复杂设备，实用性强，方法简单，操作方便。

18、(3)本发明提供了一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体微球及其在卵巢功能修复中的应用，突破了外泌体类治疗剂存活时间短、释放不稳定的特征，使其在小鼠卵巢中稳定发挥生物学功能。

19、经人脐带提取脐带动脉旁干细胞，传代培养后，经过lps刺激，促使其分泌大量且富含ccn1和lgmn等抗炎、促血管生成相关因子的外泌体，将外泌体与hama混合后，经过微流控电喷，紫外光固化，获取大小均一、生物相容性高、结构相对稳定的水凝胶微球。该水凝胶微载体结构将有助于外泌体结构保护和持续的外泌体释放，将比常规的外泌体相比具有更高的效率和更持续的促进作用。通过体外外泌体的鉴定和微球性质的评估，确定稳定的制备体系。我们通过颗粒细胞凋亡实验及体外血管成环实验验证hama联合外泌体可以治疗卵巢功能衰退。

技术特征：

1.一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，由以下步骤制备：

2.根据权利要求1所述的一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，所述hama溶液由以下步骤制备：

3.根据权利要求1所述的一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，所述脐带动脉旁干细胞来源外泌体来自于新生儿脐带。

4.根据权利要求1所述的一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，所述脐带动脉旁干细胞来源外泌体由以下步骤制备：

5.根据权利要求1所述的一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，所述微球平均直径为200μm左右。

6.根据权利要求1所述的一种负载脐带动脉旁干细胞来源外泌体的可注射微球，其特征在于，电喷中的参数如下：流速为200μm/s，高压直流电5kv，接收距离为8～10cm，毛细玻璃管直径为100μm，加入正己烷清除硅油，正己烷挥发后，用含2％双抗pbs重悬微球。

7.如权利要求1-6任一项所述的可注射微球在制备治疗或改善缺血性卵巢早衰的药物中的用途。

8.一种治疗或改善缺血性卵巢早衰的注射液，其特征在于，所述注射液中含有如权利要求1-6任一项所述的可注射微球。

9.根据权利要求8所述的注射液，其特征在于，所述可注射微球溶解于pbs中。

技术总结本发明属于生物医药领域，具体公开了一种脐带动脉旁干细胞来源外泌体微球、注射液及其制备方法和应用，所述外泌体的获得方法包括脐带动脉培养后衍生出动脉旁干细胞，培养基中加入脂多糖(LPS)刺激，获得培养上清，随后经过超速离心等步骤，获得脐带动脉旁干细胞来源外泌体，这些外泌体含有CCN1和LGMN等促血管生成蛋白；利用甲基丙烯酰化透明质酸溶液重悬脐带动脉旁干细胞来源外泌体，经微流控泵及紫外光固化制成均匀微球，注射用PBS重悬制成脐带动脉旁干细胞外泌体微球注射液；经过实验验证，上述脐带动脉旁干细胞外泌体微球注射液明显改善了缺血性卵巢早衰模型小鼠的血管新生，具有良好的成药潜力，可以应用于制备治疗或改善缺血性卵巢早衰的药物。技术研发人员：丁利军,孙海翔,李一凡受保护的技术使用者：南京鼓楼医院技术研发日：技术公布日：2024/8/1