一种基因-化学药物共递送系统及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药，尤其涉及一种基因-化学药物共递送系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、肝细胞癌(hcc)因其高度异质性、低氧环境和免疫抑制的肿瘤微环境(tme)，常表现出固有的化疗耐药性，限制了治疗选项并导致预后不佳。对于无法通过手术或肝移植治疗的晚期hcc患者，全身治疗成为主要选择。目前，肝癌治疗策略转向免疫检查点抑制剂(icis)与其他疗法联合应用。

2、eg5(ksp)，一种在细胞分裂过程中至关重要的运动蛋白，通过促进双极纺锤体的形成发挥作用。基于eg5在正常与肿瘤组织中的差异表达，开发针对eg5的选择性抑制剂作为潜在的微管靶向药物(mta)替代品，以减轻副作用如神经毒性和骨髓抑制。尽管eg5抑制剂在体外展示出强效活性，但由于实体瘤中分裂细胞比例低以及有丝分裂运动蛋白的功能可塑性导致的耐药性，其在临床试验中未能成功。研究显示，eg5抑制剂与其他抑制剂如filanesib结合使用可能提高治疗效果，但尚未获得广泛验证或fda批准。随着对免疫学的深入了解，研究重点已转向探索有丝分裂靶向药物的免疫调节作用，包括通过激活cgas/sting或焦亡途径促进炎症反应，以及治疗性干预激活的自噬过程可能诱发的免疫耐受和耐药性。

3、自噬通过促进免疫抑制性tme的形成和损害抗原呈递，对治疗反应产生负面影响。尽管目前的自噬抑制剂如氯喹(cq)和羟氯喹(hcq)未能在临床上产生可靠反应，但自噬抑制剂与抗癌药物的联合使用，用于克服肿瘤的免疫耐受和耐药性仍然是肿瘤治疗的创新型策略。

4、本发明提出一种治疗策略，旨在通过联合应用ksp sirna和调节自噬的药物，克服hcc的免疫耐受和化疗耐药性。这种策略不仅针对肿瘤细胞的核心分裂机制，还通过调节肿瘤自噬途径，增强免疫应答，为肝癌治疗提供新的方向。

技术实现思路

1、本发明针对hcc治疗结果受到内在或获得性耐药的严重限制，提供了一种抗肿瘤药物组合以及基于该药物组合的基因-化学药物共递送系统，即抗肿瘤药物组合物纳米粒子。

2、为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种抗肿瘤组合药物，所述抗肿瘤组合药物包括近红外二区自噬诱导剂hd和ksp sirna；其中，

3、所述近红外二区自噬诱导剂hd化学结构为：

4、

5、其中，r1，r2选自以下基团中的任一种：

6、

7、所述ksp sirna为靶向ksp且可以沉默其表达的sirna。

8、进一步地，所述ksp sirna的核苷酸序列选自seq id no.1-2、seq id no.3-4、seqid no.5-6中的任一种。

9、其中：

10、 序号 sequence(5’-3’) seq id no.1 sense:cugaagaccugaagacaaudtdt seq id no.2 antisense:auugucuucaggucuucagdtdt seq id no.3 sense:ucgagaaucuaaacuaacudtdt seq id no.4 antisense:aguuaguuuagauucucgadtdt seq id no.5 sense:cuggaucguaagaaggcagdtdt seq id no.6 antisense:cugccuucuuacgauccagdtdt

11、进一步地，所述ksp sirna的核苷酸序列为上述seq id no.1。

12、进一步地，所述组合药物中hd和ksp sirna的质量比为(1～20)：(0.5～20)，优选(1～5)：(0.5～5)，进一步优选为2:1。

13、本发明的第二方面是提供一种基因-化学药物共递送系统，包括上述的抗肿瘤组合药物以及用于包载上述抗肿瘤组合药物的纳米递送系统，所抗纳米递送系统由ph响应性聚合物以及阳离子脂质共组装而成。

14、进一步地，所述ph响应性聚合物包括meo-peg-b-pdpa和/或irgd-peg-b-pdpa；其中：

15、所述meo-peg-b-pdpa的化学结构为：其中n＝20-200，优选n＝50～100，进一步优选n＝70；

16、所述irgd-peg-b-pdpa的化学结构为：

17、

18、其中m＝20-200，优选m＝50～100，进一步优选m＝70；

19、所述阳离子脂质为g0-c14。

20、所述g0-c14的化学结构为：

21、进一步地，所述基因-化学药物共递送系统纳米粒子的粒径为100nm～500nm，优选为100nm～200nm。

22、进一步地，所述抗肿瘤组合药物共递送纳米粒子中meo-peg-b-pdpa、irgd-peg-b-pdpa、g0-c14的投料质量比为(10～30)：(1～10)：(1～10)，优选比例为(15～25)：(2～7)：(2～7)，进一步优选为20:5:5。

23、进一步地，所述基因-化学药物共递送系统中抗肿瘤药物与纳米递送系统的投料质量比为(12～50)：(1.5～20)。

24、进一步地，所述所述抗肿瘤组合药物共递送纳米粒子中meo-peg-b-pdpa,irgd-peg-b-pdpa,g0-c14,hd,ksp sirna的投料的质量比为(10～30)：(1～10)：(1～10)：(1～10)：(0.5～10)，进一步优选为20：5：5：2：1。

25、本发明的第三方面是提供上述基因-化学药物共递送系统的制备方法，包括以下步骤：

26、(1)化合物混溶：称取近红外二区自噬诱导剂hd、ksp sirna以及共递送纳米粒子的各原料，使用溶剂溶解，静置孵育5-60min；

27、(2)步骤(1)所得混合液采用纳米沉淀法、油水(o/w)乳化法、水/油/水复乳蒸发法中的任一种制备得到纳米粒子；

28、(3)步骤(2)所得纳米粒子采用pbs进行洗涤，洗涤后的纳米粒子分散在pbs缓冲溶液中，得到所述基因-化学药物共递送系统hd@ksp sirna nps。

29、进一步地，步骤(1)混合原料包括：meo-peg-b-pdpa,irgd-peg-b-pdpa,g0-c14,hd,ksp sirna。

30、进一步地，步骤(1)所述溶剂选自：四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、乙醇或甲醇中的任一种或多种。

31、进一步地，步骤(2)采用纳米沉淀法制备纳米粒子。

32、进一步地，所述纳米沉淀法包括如下步骤：在500-2000rpm磁力搅拌下，将混合物滴入0.001m-1m的pbs中，搅拌5-120min。

33、进一步地，所述纳米沉淀法中采用的搅拌转速为1000rpm；pbs浓度为0.001m，搅拌时间60min。

34、进一步地，步骤(3)所述洗涤步骤包括：将制得的混合溶液转移到超滤装置(emdmillipore,mwco 100k)中，离心去除溶剂和游离化合物，用pbs(ph 7.4)溶液洗涤三次，将洗涤后的纳米粒子分散在磷酸盐缓冲盐水(pbs,ph 7.4)溶液中，得到所述基因-化疗纳米药物共递送系统hd@ksp sirna nps。

35、本发明的第四方面是提供上述的抗肿瘤组合药物或基因-化学药物共递送系统的应用，即用于制备检测、预防或治疗肿瘤的药物。

36、进一步地，在用于制备检测肿瘤的药剂时，所述抗肿瘤组合药物或基因-化学药物共递送系统在生物体内实现近红外二区成像。

37、进一步地，在制备预防或治疗肿瘤的药物时，所述抗肿瘤组合药物或者基因-化学药物共递送系统用于抑制肿瘤细胞的增殖。

38、进一步地，所述肿瘤为肝癌肿瘤。

39、进一步地，在制备预防或治疗肿瘤的药物时，将所述抗肿瘤组合药物或者基因-化学药物共递送系统与anti-pd-1联用。

40、进一步地，在制备预防或治疗肿瘤的药物时，适应ksp sirna的给药剂量为650μg/kg/2天，适应hd的剂量为6mg/kg/2天。

41、进一步地，在制备预防或治疗肿瘤的药物并与anti-pd-1联用时，anti-pd-1的剂量为10mg/kg/2天。

42、本发明具有但不限于以下有益效果：

43、(1)本发明提供的提供一种实现肿瘤诊疗一体化的组合药物，可同时进行近红外二区成像、药物递送和疾病监测，提供一站式的医疗解决方案。通过将诊断剂和治疗剂结合在同一纳米平台上，可以确保治疗药物直接运送到疾病部位，提高治疗的精确性和效率，同时减少对健康组织的损害，在治疗过程中提供即时反馈，实时监控治疗进展，及时调整治疗方案。(2)本发明提供的基因-化学药物共递送系统，结构简单、制备过程易行，实现化学药物与基因药物的共同携带目标特异性药物递送，实现药物递送和诊断的一体化。ph响应性聚合物纳米粒子实现肿瘤酸性ph环境下释放药物，使药物可以更精确地定位到病变部位，减少对正常组织的影响。通过控制药物在特定ph条件下的释放，可以提高药物在目标部位的浓度，从而提高治疗效果，同时减少药物总用量，降低副作用风险。

44、(3)本发明提供的治疗肿瘤的组合药物及其共递送纳米粒子，通过敲低ksp并在g2/m期阻止有丝分裂来抑制多种肝癌细胞系的细胞生长。此外，hd成功抑制了ksp sirna诱导的自噬依赖性mhc-i降解，并协同作用诱导焦亡。该抗肿瘤药物组合物纳米粒子在肝癌异种移植小鼠模型中表现出优越的肿瘤积累效率和最小的脱靶效应。静脉注射纳米组合药物抑制肿瘤的自噬，增加树突状细胞和cd8+t细胞的频率，下调髓源性抑制细胞，促进促炎细胞因子的表达。在肝癌异种移植和原位小鼠模型中，恢复抗原呈递和逆转免疫抑制性肿瘤微环境，成功致敏了基于pd-1的抗肿瘤联合治疗，激发了免疫记忆并显著抑制了肿瘤生长。该组合物纳米粒子显示出比单一疗法更好的治疗效果，具有临床应用潜力。