一种MhpP46蛋白的获取方法和胶体金免疫层析试纸条

本发明涉及生物工程，特别是涉及一种mhp p46蛋白的获取方法和胶体金免疫层析试纸条。

背景技术：

1、猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae，mhp)是临床上常见的病原，感染后可引起猪支原体肺炎(mycoplasmalpneumonia ofswine，mps)，该病病程长，为慢性、接触性呼吸道传染病。1965年，switzer、goodwin和mare首次分离得到病原，并成功地复制出该病，随后该病原被命名为m.hyopneumoniae。该病死亡率低，发病率高，在世界范围内流行，患病后病猪出现轻微干咳及高热，以致饲料转化率及日增重降低，影响养殖场的经济效益。

2、在感染早期，病猪发热症状明显，可达39-40℃，可持续3-9天，干咳或少痰，并随着时间推移咳嗽症状逐渐加重。同时伴随着精神不振、食欲不佳、呼吸困难、鼻塞流鼻涕等症状。到感染的中期，呼吸道症状再次加重，呼吸音加强，出现湿啰音、哮鸣音，同时日常圈舍巡查可见患病猪因腹痛而体态异常，栏位附近出现因呕吐和腹泻产生的污物，体温升高至38.5℃之上。至感染后期，呼吸道症状进一步加强，出现频繁且有力的干咳或带痰咳嗽，救治不及时甚至会因呼吸困难乃至窒息死亡，患病猪精神沉郁、躺卧不起，甚至拒食、无力饮水，进而因营养不良，体重不断下降，此时高烧依旧持续。至此，患病猪免疫力低下，易受其他病原继发感染。

3、一月龄前的仔猪、哺乳期和妊娠期的母猪。发病时常见急性型，可见突然发病，干咳、气喘、呼吸困难，高烧，急性型死亡率较高，需要及时救助。架子猪、育肥猪和后备母猪发病则常见慢性型。可由初期干咳演化为痉挛性咳嗽，可见呼吸困难，腹式呼吸，病重者呼吸道分泌大量粘液，病猪免疫力下降，精神不振，生长缓慢，饲料转化率降低，动物性产品产出减少，影响猪场的经济效益。隐形型则常见于成年育肥猪，多由急性型和慢性型演变而来。一般症状不明显，少部分会在运动、进食后表现出轻微的呼吸道症状。必须通过剖检、x射线检查，才能检出。隐性带毒猪，是mhp的主要传染源之一，对猪场危害巨大。

4、mhp感染虽然致死率低，但其发病率较高，发病后难以净化，其免疫抑制及破坏免疫屏障的特点使得患病动物易于受到其他病原的二次感染，且研究表明，联合感染会加剧病原对机体造成的损伤，产生更大的经济损失，持续阻碍着猪养殖业的发展。及早地诊断并采取隔离、治疗等措施，也是mhp防控工作中地关键一环，目前市场上常用的进口试剂盒价格昂贵，缺乏经济、灵敏、快速、有效的mhp检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种mhp p46蛋白的获取方法和胶体金免疫层析试纸条，本发明通过hek293f真核表达系统表达并纯化得到了纯度高、反应性好的p46重组蛋白，进而建立了胶体金免疫层析试纸条，为临床检测及免疫评价提供技术支持。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种mhp p46蛋白的获取方法，包括以下步骤：

4、1)将mhp p46基因连接到pcaggs中，得到pcaggs-p46重组质粒；

5、2)将pcaggs-p46重组质粒转化至jm109大肠杆菌感受态细胞中进行扩增，使用无内毒素质粒提取试剂盒大量回收质粒；

6、3)将所述步骤2)得到的pcaggs-p46重组质粒转染至hek293f细胞中，进行真核表达；

7、4)将所述步骤3)得到的培养细胞冻融、破碎后纯化目的蛋白，得到mhp p46蛋白。

8、优选的，所述步骤1)mhp p46基因的登录号为nc_006360.1。

9、优选的，所述步骤3)pcaggs-p46重组质粒的质量与hek293f细胞的体积比为50μg:50ml。

10、优选的，所述hek293f细胞的细胞密度为2.0～2.5×106cells/l。

11、优选的，所述步骤3)培养的条件包括：在37℃、5％co2和150～175rpm下培养，所述培养的时间在72h以上。

12、本发明还提供了一种胶体金免疫层析试纸条，包括支撑底板和在支撑底板上从左至右依次连接的样品垫、金标结合垫、nc膜和吸水垫；

13、所述nc膜上设置有t线和c线；

14、所述t线上喷涂有葡萄球菌a蛋白；

15、所述c线喷涂有兔抗p46重组蛋白多克隆抗体，所述兔抗p46重组蛋白多克隆抗体由上述技术方案中mhp p46蛋白免疫兔后获得；

16、所述金标结合垫上喷涂有胶体金标记蛋白，所述胶体金标记蛋白由胶体金标记上述技术方案中mhp p46蛋白后得到。

17、优选的，所述葡萄球菌a蛋白的喷涂量为1μl/cm，喷涂浓度为0.4～1.2mg/ml。

18、优选的，所述兔抗p46重组蛋白多克隆抗体的喷涂量为1μl/cm，喷涂浓度为0.6～1.4mg/ml。

19、优选的，所述胶体金标记蛋白的喷涂量为2～8μl/cm，浓度为1.3ng/μl。

20、优选的，所述葡萄球菌a蛋白的喷涂浓度为1mg/ml；

21、所述兔抗p46重组蛋白多克隆抗体的喷涂浓度为1.2mg/ml；

22、所述胶体金标记蛋白的喷涂量为4μl/cm。

23、本发明的有益效果为：

24、p46蛋白是mhp的免疫优势抗原之一，可以刺激机体较早地产生特异性抗体，在检测及疫苗相关研究中得到了广泛的关注和研究。本试验通过制备纯度高、反应性好、稳定的p46蛋白，开发、优化并最终建立了胶体金免疫层析试纸条及抗体检测方法。研究结果如下：

25、1.根据ncbi中mhp 232菌株p46基因序列(登录号：nc_006360.1)合成目的基因，构建了转染效率高、表达稳定的pcaggs-p46真核表达载体，转染hek293f细胞后成功表达了p46重组蛋白。经镍亲和层析柱纯化、sds-page和western blot验证后，得到了纯度较高、反应性好、稳定的p46重组蛋白。

26、2.以上述得到的p46重组蛋白为免疫原，免疫实验动物获得高效价的多克隆抗体。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金，标记p46重组蛋白，制备金标抗原。通过对金标抗原制备流程、t线spa最佳喷涂浓度、c线多克隆抗体最佳喷涂浓度、金标抗原最佳喷涂量进行一系列的优化，最终建立了mhp胶体金免疫层析试纸条抗体检测方法。该方法具有良好的稳定性、特异性及灵敏度，且成本较低，操作简便。与idexx间接elisa抗体检测试剂盒阳性血清符合率可达86.6％，阴性血清符合率可达100％。

27、综上所述，本发明通过hek293f真核表达系统表达mhp p46蛋白，纯化后得到了反应性好、纯度高、稳定的p46重组蛋白，并以此为基础开发和建立了胶体金免疫层析试纸条。具有较好的稳定性、特异性、灵敏度。在快速检测方面具有显著优势。综上，本发明为临床检测及免疫后抗体水平监测提供了技术支持。