一种酰基转移酶及其应用

本发明属于基因工程，特别是涉及一种酰基转移酶及其应用。

背景技术：

1、呕吐毒素(deoxynivalenol，don)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇或脱氧萎镰菌醇，是由禾谷镰刀菌所产生的单端胞霉烯族毒素，是为数不多引起农业领域重视的b型毒素复合物。在玉米、小麦、大麦、燕麦等谷物的生长和储存过程中极易感染，近年来镰刀菌属引发的赤霉病严重影响着我国各地的农作物，小麦赤霉病在大流行年份可使小麦减产59％以上。2022年对国内16个省市的饲料和原料进行霉菌毒素测定，其中玉米和玉米副产的don检出率分别是97.15％和100.00％，小麦及麸皮检出率也高达100.00％，全价料中don的检出率也达到了100.00％，可见don污染在玉米副产物及全价料中污染比较严重(苏青云，etal.2024)。2023年江西省地方特色预包装食品102分样品中don的检出率为86.3％(周鸿，etal.2023)。

2、近年来，随着基因工程技术越发成熟和各类组学如蛋白组学、转录组学的快速发展，为降解don等这一类真菌毒素降解酶的研究提供了更为成熟的设计平台，较为常见的生物酶挖掘策略有通过筛选出具有降解功能的微生物，对菌株进行蛋白组学、转录组学、代谢组学等结合分析，快速准确地定位到降解酶组分，并通过全基因组这一类分子生物学技术确定生物酶相关基因，并采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等异源表达方法，逐步筛选获得的降解酶编码基因，liu(liu，et al.2023)等人就是通过转录组分析找到了一种参与don转化为3-adon的不动杆菌酰基转移酶。随着生物信息学的快速发展，新型降解酶挖掘策略可以通过将已有的降解酶相关信息通过计算机辅助运算在各大数据库基因组序列及蛋白信息中进行检索和分析，并同时进行归纳和构建生物酶数据库，预测与已有降解酶相关的其他生物酶类，将预测的生物酶进行功能验证，筛选出新的降解酶基因。

3、目前，未见与本发明相关的基因及用途的报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种酰基转移酶agpat-k1，其氨基酸序列如seq id no:1所示，编码氨基酸的核苷酸序列如seq id no:2所示；其来源于乳酸片球菌rb-24l(pediococcusacidilactici rb-24l)，本发明提供的酰基转移酶agpat-k1能够降解呕吐毒素(don)，可以在降解don方面得到应用。

2、本发明从云南省农贸市场购买的乳饼中分离得到一株乳酸片球菌rb-24l（ pediococcus acidilacticirb-24l），其于2023年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，菌种保藏号为cctcc no: m 2023267。

3、本发明另一目的是将上述酰基转移酶应用在降解呕吐毒素中。

4、本发明目的通过以下技术方案实现：

5、1、从云南省农贸市场购买的乳饼中分离获得乳酸片球菌rb-24l；

6、2、提取乳酸片球菌rb-24l的基因组dna，以dna为模版，采用引物a0a833tnk1-f：cggaattcgatgttgtatacatttattaaacatcta；a0a833tnk1-r：cccaagctttttggacgctttttttgtatggg；扩增获得基因a0a833tnk1；

7、3、基因a0a833tnk1原核表达载体的构建，降解酶agpat-k1的表达，分离纯化；

8、4、降解酶agpat-k1酶学性质研究以及重组菌k1降解don的产物分析。

9、本发明的优点和技术效果：

10、1、本发明从乳饼中筛选出的具有降解don活性的乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)rb-24l，并从中扩增获得具有don降解活性的降解酶基因a0a833tnk1，并实现了其在大肠杆菌中的异源表达，构建了高效表达降解酶agpat-k1的基因工程菌株a0a833tnk1，并验证了蛋白浓度5mg/ml的重组菌a0a833tnk1发酵上清液能将10μg/ml的don降解53.74±1.62％；

11、2、本发明降解酶agpat-k1通过ncbi数据库对比发现其为酰基转移酶，但与报道的don降解酶序列相似度降低，推测降解酶agpat-k1是新型的don降解酶；1mg/ml的agpat-k1在ph 7.5、37℃、nadph和乙酰辅酶a参与下，并在ca2+促进下孵育12h对5mg/l的don降解率可达到81.712±1.91％；

12、3、本发明酰基转移酶agpat-k1具有较好的热稳定性，在20-60℃对don都具有降解作用，在60℃处理12h，酰基转移酶agpat-k1对5mg/l的don降解率仍能达到20％左右；酰基转移酶agpat-k1在ph6.5-8范围内表现出稳定的酶活，ph在7.5时对don降解率达到最高81.76±2.9％；在k+、mg2+、zn2+、ca2+、fe2+五种金属离子中，1g/l的ca2+对酰基转移酶agpat-k1降解don具有极为显著的促进作用，降解率可达81.712±1.91％；

13、4、本发明agpat-k1能将don转化生成低毒的质荷比([m+h]+)为288.19的降解产物m1。因此，agpat-k1具有潜在的工业应用前景。

技术特征：

1.一种酰基转移酶agpat-k1，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的酰基转移酶在降解呕吐毒素中的应用。

3.一种酰基转移酶基因a0a833tnk1，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

4.一种含有权利要求3所述酰基转移酶基因a0a833tnk1的重组菌株发酵液在降解呕吐毒素中的应用。

技术总结本发明公开了一种酰基转移酶AGPAT‑K1，其来源于乳酸片球菌RB‑24L，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，酰基转移酶AGPAT‑K1对呕吐毒素具有较好降解性能，将酰基转移酶基因转入大肠杆菌中获得重组菌株K1，重组菌株K1发酵上清液能够将DON降解生成质荷比([M+H]+)为288.19的降解产物M1，并且降解产物M1对动物细胞、植物和细菌的毒性显著低于脱氧雪腐镰刀菌烯醇，实验表明重组菌株K1发酵上清液具有降解DON的能力，本发明为乳酸菌和生物酶降解食品、饲料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇提供有效的理论支撑和候选物，为工业使用生物酶和乳酸菌进行生物脱毒提供安全依据。技术研发人员：杨恩,李瑜玲,张乐,黄若琪受保护的技术使用者：昆明理工大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16