一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其构建方法与应用与流程

本发明属于合成生物学，具体涉及一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononuclotide，简称nmn)属于天然存在的生物活性核苷酸，是生物体内辅酶i烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的直接前体。nad+介导包括线粒体功能、能量代谢、细胞衰老和死亡等上千种体内生物催化过程，其代谢异常严重影响机体细胞和组织的健康。nad+分子量大，无法直接通过口服转运至胞内，人体内主要通过以nmn为重要中间产物的补救合成途径补充85％的nad+，维持随年龄而降低的nad+水平。

2、目前合成nmn的主要方法包括：化学合成、生物催化法。其中化学法成本高，同时造成环境污染，已逐渐被生物催化法取代。相比较而言，以烟酰胺核糖(nr)和三磷酸腺苷(atp)为原料通过烟酰胺核糖激酶一步反应生成nmn的生物催化法已成为nmn工业化生产的主要方式。然而，现阶段双酶法的生物催化法存在酶活力低，nmn终浓度不高，且需要较高摩尔比例的atp作为底物提供磷酸基团，原料成本高，同时产生的大量amp难以通过树脂有效分离，增加了纯化难度，并极大影响了产品质量和生产成本。

3、目前，有三种生物催化方法生产nmn，第一种是以烟酰胺核糖为原料，通过烟酰胺核糖激酶(ribosylnicotinamide kinase，ec 2.7.1.22)在atp供应下生成nmn。第二种是以烟酰胺、核糖和atp为底物，经d-核糖激酶(ribokinase，ec2.7.1.15)、核酸磷酸焦磷酸激酶(ribose phosphate pyrophosphokinase，ec2.7.6.1)、和烟酰胺核糖磷酸转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，ec.2.4.2.12)催化反应生成nmn。第三种是以腺苷或amp、atp、烟酰胺为原料，经腺苷激酶(ec 2.7.1.20)(以amp为原料时不需要此酶)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(ec 2.4.2.7)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase，ec.2.4.2.12)催化生成nmn。

4、上述第一种方法直接以烟酰胺核糖为原料，底物转化率高，但烟酰胺核糖价格昂贵，成本不具有优势。第二种、第三种方法最后均以prpp和烟酰胺通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，ec.2.4.2.12)制备nmn。因烟酰胺磷酸核糖转移酶催化可逆反应，合成nmn的同时也能水解nmn，反应转化率较低。同时，中间体prpp化合物不稳定，不利于反应进行。再次，上述两种方法多步反应均需要atp参与反应，整条工艺路线需要消耗大量的atp，导致该生物催化法的生产成本仍较高。

5、公开号为cn117448250a，申请日为2023年11月28日的中国专利公开了一种高效酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，使用ppk2和nrk粗酶液转化nr-cl和atp合成nmn，nmn产量为127.6g/l(380mm，nr投料390mm)，但是atp摩尔添加量为nr的8.97％；公开号为cn115725481a，申请日为2021年9月2日的中国专利公开了产β-烟酰胺单核苷酸重组菌及其构建方法和产β-烟酰胺单核苷酸的方法和应用，使用nrk和ppk2粗酶液转化nr合成nmn，nmn产量为260mm(nr投料300mm)，atp摩尔添加量为nr的5％，底物转化率99.89％。然而价格昂贵的atp增加了上述两种方法的生产成本，且浓缩以后amp大量富集，增加了下游分离纯化的难度。

6、因此，综上所述开发一种更为高效、低成本，且能够制备高浓度β-烟酰胺单核苷酸的新方法有着十分重要的实用意义和巨大的应用潜力。

技术实现思路

1、为解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株及其构建方法与应用，将烟酰胺核糖激酶野生型或突变体和多聚磷酸激酶野生型或突变体的编码基因通过重组载体导入受体菌，构建得到所述重组菌株，并利用所述重组菌株实现β-烟酰胺单核苷酸的高产量、高浓度和nr的高转化率。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的目的之一在于提供一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中含有烟酰胺核糖激酶野生型或突变体的编码基因和多聚磷酸激酶野生型或突变体的编码基因，其中所述烟酰胺核糖激酶野生型的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述烟酰胺核糖激酶突变体由来源于酵母菌的野生型烟酰胺核糖激酶蛋白的第t4位、第c33位、第k84位以及第k102位中至少一处突变而得到；所述多聚磷酸激酶野生型的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述多聚磷酸激酶突变体由来源于蜡杆菌的野生型多聚磷酸激酶蛋白的第g34位、第f48位、第w145位、第v300位以及第t317位中至少一处突变而得到。

4、进一步的，所述野生型烟酰胺核糖激酶的碱基序列如seq id no.1所示，由氨基酸序列seq id no.3进行如下突变得到：

5、a1、将氨基酸序列seq id no.3中第t4位的苏氨酸突变为谷氨酸；

6、a2、将氨基酸序列seq id no.3中第c33位的半胱氨酸突变为天冬氨酸；

7、a3、将氨基酸序列seq id no.3中第k84位的赖氨酸突变为谷氨酸；

8、a4、将氨基酸序列seq id no.3中第k102位的赖氨酸突变为天冬氨酸。

9、进一步的，所述野生型多聚磷酸激酶的碱基序列如seq id no.2所示，由氨基酸序列seq id no.4进行如下突变得到：

10、b1、将氨基酸序列seq id no.4中第g34位的甘氨酸突变为天冬氨酸；

11、b2、将氨基酸序列seq id no.4中第f48位的苯丙氨酸突变为谷氨酸；

12、b3、将氨基酸序列seq id no.4中第w145位的色氨酸突变为天冬氨酸；

13、b4、将氨基酸序列seq id no.4中第v300位的缬氨酸突变为谷氨酸；

14、b5、将氨基酸序列seq id no.4中第t317位的苏氨酸突变为谷氨酸。

15、本发明的目的之二在于提供一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸重组菌株的构建方法，将烟酰胺核糖激酶野生型编码基因和多聚磷酸激酶野生型编码基因通过重组载体导入受体菌，从而构建所述用于合成β-烟酰胺单核苷酸重组菌株。

16、本发明的目的之三在于提供另一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸重组菌株的构建方法，对上述含有烟酰胺核糖激酶野生型编码基因和多聚磷酸激酶野生型编码基因的重组载体进行突变，使烟酰胺核糖激酶野生型编码基因突变为烟酰胺核糖激酶突变体编码基因，多聚磷酸激酶野生型编码基因突变为多聚磷酸激酶突变体编码基因，而后将重组载体导入受体菌，构建所述用于合成β-烟酰胺单核苷酸重组菌株。

17、进一步的，所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述基因改造而得到：

18、c1、将嘌呤核苷磷酸化酶基因deod敲除，该改造以δdeod表示；

19、其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因deod编码氨基酸序列seq id no.5所示的蛋白质，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因deod为c11-c13中的任一种dna分子：

20、c11、其编码序列是seq id no.6的cdna分子或基因组dna；

21、c12、在严格条件下与c11限定的dna分子杂交且编码所述嘌呤核苷磷酸化酶的cdna分子或基因组dna；

22、c13、与c11或c12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述嘌呤核苷磷酸化酶的cdna分子或基因组dna；

23、在进行c1基因改造的前提下再进行下述基因改造或者直接对野生型大肠杆菌进行基因改造，得到所述突变型大肠杆菌：

24、d1、将核苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha敲除，该改造以δusha表示；

25、其中，所述核苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha编码氨基酸序列seq id no.7所示的蛋白质；所述核苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha为d11-d13中的任一种dna分子：

26、d11、其编码序列是seq id no.8的cdna分子或基因组dna；

27、d12、在严格条件下与d11限定的dna分子杂交且编码所述核苷酶的cdna分子或基因组dna；

28、d13、与d11或d12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述核苷酶的cdna分子或基因组dna。

29、进一步的，所使用的术语“同一性”指与天然核苷酸序列的序列相似性；

30、进一步的，对野生型大肠杆菌进行所述c1和d1改造得到突变型大肠杆菌d1；

31、对野生型大肠杆菌进行所述c1改造得到突变型大肠杆菌d2；

32、对野生型大肠杆菌进行所述d1改造得到突变型大肠杆菌d3；

33、进一步的，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因deod和核苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha的敲除均可通过同源重组实现。

34、进一步的，所述重组载体中启动烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸激酶的编码基因转录的启动子是ara启动子，终止烟酰胺核糖激酶和多聚磷酸激酶合成酶基因转录的终止子是rrnb终止子。

35、本发明的目的之四在于提供一种用于合成β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株在制备高浓度β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

36、进一步的，所述制备高浓度β-烟酰胺单核苷酸步骤如下：

37、s1、将重组菌株经无机盐高密度培养，加入阿拉伯糖诱导后得到诱导重组菌；

38、s2、收集所述诱导重组菌进行高压均质破碎，一次性加入烟酰胺核糖，补加一次六偏磷酸钠溶液，催化合成β-烟酰胺单核苷酸，得到转化液；

39、s3、转化液经经离心除菌、膜过滤去除蛋白多肽、阴离子树脂纯化、纳滤浓缩、乙醇结晶、真空干燥等后处理后得到高浓度的β-烟酰胺单核苷酸。

40、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

41、1、本发明首次构建了一种新型生产高浓度β-烟酰胺单核苷酸的重组菌株，通过突变筛选高比活、耐高浓度底物的烟酰胺核糖激酶野生型或突变体和多聚磷酸激酶野生型或突变体，然后利用重组载体导入到突变型大肠杆菌中而构建形成，重组菌株能够在不影响菌体生长的前提下最大限度弱化烟酰胺核糖和腺苷酸的分支途径，有效地提高β-烟酰胺单核苷酸的浓度和烟酰胺核糖盐的摩尔转化效率。

42、2、将本发明所构建的重组菌株应用于制备β-烟酰胺单核苷酸，重组菌株经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌，诱导表达的重组菌株以不高于600mm的烟酰胺核糖盐为底物，只须补加一次六偏磷酸钠，即可高效地制备β-烟酰胺单核苷酸；转化6h后，β-烟酰胺单核苷酸的浓度可达到150g/l，烟酰胺核糖的转化率在97％以上，便于下游结晶精制，并且产品纯度在99.5％以上。

43、3、利用本发明提供的重组菌株制备β-烟酰胺单核苷酸，不仅可以提高nr的转化浓度和amp的循环速率，实现β-烟酰胺单核苷酸的高产量、高浓度和nr的高转化率，而且制备工艺简单、合成效率高且生产成本低，能够有效简化下游分离纯化工艺，获得高品量的nmn产品，在β-烟酰胺单核苷酸工业化生产领域具有良好的应用前景。

44、附图标记

45、图1为本发明实施例1中所述重组菌株nkc01转化烟酰胺核糖nr合成β-烟酰胺单核苷酸nmn的产量图；

46、图2为本发明性能测试1中重组菌株nkc01、nkc02或nkc03在400mm nr底物条件下合成β-烟酰胺单核苷酸nmn的产量变化图；

47、图3为本发明性能测试1中重组菌株nkc01、nkc02或nkc03在500mm nr底物条件下合成β-烟酰胺单核苷酸nmn的产量变化图；

48、图4为本发明性能测试中1重组菌株nkc01、nkc02或nkc03在600mm nr底物条件下合成β-烟酰胺单核苷酸nmn的产量变化图；

49、图5为本发明性能测试2中重组菌株nkc03、nkc04、nkc05和nkc06合成β-烟酰胺单核苷酸nmn的产量变化图。