一种ZIF-67/AgNPs/AuNWs三元复合材料的制备方法及其结合TLC-SERS芯片定量检测MC-LR含量的方法

本发明涉及养殖类水产品中微囊藻毒素-亮氨酸精氨酸(mc-lr)含量的检测方法，尤其是涉及一种zif-67/ag nps/au nws三元复合材料的制备方法及其结合tlc-sers芯片定量检测环境中mc-lr含量的方法。

背景技术：

1、微囊藻毒素(microcystins，mcs)是这些蓝藻的典型次生代谢物，蓝藻生长期mcs主要以细胞内毒素的形式存在，但细胞死亡或外部作用力将导致藻细胞溶解或破裂，使mcs释放到细胞外而溶解于水环境中，其中污染最普遍、危害最严重的是微囊藻毒素-亮氨酸精氨酸mc-lr(占总mcs质量浓度的46.0％～99.8％)。其发挥毒性作用的主要机制是抑制蛋白磷酸酶(pp1)和蛋白磷酸酶(pp2a)的活性，从而引起细胞蛋白的过度磷酸化，造成细胞炎症和凋亡，甚至引起dna损伤，肝脏是mc-lr毒性效应最主要的靶器官。蓝藻存在于大多数淡水水体中(包括饮用水源、鱼类养殖等水环境)，能有效利用光和养分而具有竞争繁殖优势，水华频繁暴发产生的蓝藻毒素直接危害饮用水安全，并且在以藻类为食的养殖水产品体内初步积累，人类食用受污染的水产品后，该毒素也会在人体内大量富集且无法代谢，成为生态与环境科学领域持续关注的热点前沿问题之一。于是，亟需建立一种快速、灵敏的mc-lr定量测定方法，用于更好的监测所养殖的水产品是否受到mc-lr的污染以及被污染的程度。

2、目前，国内外对mc-lr进行定量分析的方法多种多样，其中高效液相色谱法(hplc)和免疫测定法因其灵敏度和稳定性令人满意而得到广泛应用。但在实际应用中，这些现有方法所需的精密仪器、繁琐的操作和高昂的成本与食品基质的现场监测不相适应，且不能有效排除实际环境中干扰的内在共存性。因此，开发一种更为简便、灵敏度高且适用于食品现场检测的mc-lr快速检测方法具有重要意义。

3、拉曼光谱在特征性检测方面的优势是显著的，不同的分子结构能够产生“指纹”级别的特异性拉曼信号。因其高灵敏度、诱人的特异性和非破坏性的本质等优势，在生物医学、环境监测、食品安全等领域被广泛应用。通常情况下，sers活性基底中最常采用的是贵金属材料，如金、银和铜等。然而，基于传统的等离子体金属基底的生物相容性和结构稳定性不足，是阻碍其实际应用的主要问题。此外，但仅运用单一的sers技术检测食品基质中超低浓度的被测对象时，由于基质中复杂组分的影响会对sers检测的准确度造成一定的干扰。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够增强sers强度的zif-67/ag nps/aunws三元复合材料的制备方法及其结合tlc-sers芯片定量检测环境中mc-lr含量的方法，该方法具有简单、快速、灵敏度和准确性高。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种zif-67/ag nps/au nws三元复合材料的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)通过au种子介导法合成aunws；

4、(2)通过磁控溅射在au nws上直接溅射ag nps形成ag nps/au nws；

5、(3)zif-67的原位合成

6、将20μl的溶液a滴在ag nps/au nws表面，待其完全干燥后，再滴加8μl溶液b，干燥后再滴加4μl的溶液a，然后通过滴加5μl甲醇延长反应时间，合成得到sers性能显著增强的zif-67/ag nps/au nws三元复合材料，其中溶液a为浓度2.4-6mg/ml的co(no3)2的甲醇溶液，溶液b为浓度为0.8-2mg/ml的2-mi的甲醇溶液。

7、进一步，步骤(1)具体如下：利用等离子体处理支撑体10min，然后将支撑体浸泡在20μl/ml aptes溶液中2h，使其表面带正电荷；接着将支撑体浸入au种子胶体中90min后，在洗净的烧杯中加入1ml乙醇为介质，向其中依次加入200μl浓度为1.54mg/ml的4-mba溶液、50μl浓度为17mg/ml的haucl4溶液、吸附有au种子的支撑体和300μl浓度为3.5mg/ml l-aa的溶液，通过轻微振荡使生长液均匀混合，然后静置反应40min，在支撑体上得到au nws；反应结束后，用乙醇和水冲洗，去除未键合的aunps及其他残留物，用30min紫外线照射降解4-mba，得到aunws。

8、进一步，所述的au种子胶体的制备方法步骤如下：首先在剧烈的磁力搅拌下，将19.7μl浓度为100mg/ml的haucl4溶液和100μl浓度为14.7mg/ml柠檬酸钠溶液迅速加入20ml去离子水中，待溶液变为无色后，向其中加入冰水浴的600μl浓度为3.783mg/ml的nabh4溶液，可以观察到混合物瞬间变为棕色，持续搅拌10min后将反应体系从磁力搅拌器上移除，并且通过静置老化2h获得稳定的au种子胶体。

9、进一步，所述的支撑体为硅晶片或者胶带。

10、进一步，步骤(3)具体为：首先，以每滴5μl的速度将20μl的溶液a滴在ag nps/aunws表面，待其完全干燥后，再以每滴4μl的速度滴加8μl溶液b，干燥后再滴加4μl的溶液a，以去除未能完成反应的2-mi，最后，通过滴加5μl甲醇延长反应时间40-50min，合成得到sers性能显著增强的zif-67/ag nps/au nws三元复合基底。

11、进一步，所述的溶液a为浓度4.8mg/ml的co(no3)2的甲醇溶液，所述的溶液b为浓度为1.6mg/ml的2-mi的甲醇溶液。

12、本发明还提供一种上述制备方法制备得到的zif-67/ag nps/au nws三元复合材料在检测养殖环境和水产品中mc-lr含量的应用。

13、进一步所述的zif-67/ag nps/au nws三元复合材料结合tlc-sers芯片定量检测环境中mc-lr含量的方法包括以下步骤：

14、(1)tlc-sers芯片的制备

15、采用胶带为支撑体制备得到具有粘性的zif-67/ag nps/au nws三元复合基底，即为柔性sers基底膜；将柔性sers基底膜和胶带分别切割成尺寸相同的小块后，将胶带粘贴到载玻片上距离其顶部1cm的位置；然后硅胶糊状混合物快速涂布在载玻片表面，并且不断振动载玻片使其均匀分布，最终形成0.2-0.4mm的薄层；硅胶层干燥后，将载玻片置于110℃烘箱中活化1h，然后将胶带连同上层的硅胶一起撕下，粘贴替换成相同尺寸的柔性sers基底膜，形成一个具有sers增强基底通道的tlc板，即tlc-sers芯片；

16、(2)样品的富集

17、用定量毛细管将20μl含有mc-lr分子的待测样品溶液涂抹到距离底部1.0cm的tlc-sers芯片上形成斑点；然后将tlc-sers芯片置于室温下，直至溶剂完全挥发；同时将2-3ml的流动相加入层析缸中，在室温下放置30min以上，直至达到蒸汽饱和然后，将tlc-sers芯片竖直放入进行色谱分离，点样中的分析物在毛细作用下逐渐迁移，分离过程一直持续到流动相液面距离顶部1.0cm处时，随后将tlc-sers芯片置于通风橱中干燥；

18、(3)sers检测

19、取一系列不同浓度的mc-lr分子溶液滴在tlc-sers芯片的sers增强基底通道上，直接置于拉曼显微镜下用于记录sers增强带中mc-lr分子的sers信号，得到sers特征峰信号强度，采用线性回归方法建立mc-lr浓度与特征峰信号强度之间的线性关系，根据建立的mc-lr浓度与特征峰信号强度之间的线性关系，判定待测样品溶液是否被mc-lr污染以及被污染样品中mc-lr的含量。

20、进一步，步骤(1)中所述的硅胶糊状混合物的制备方法如下：将10.0g tlc硅胶用30.0g质量浓度为0.5％的cmc-na溶液分散和浸润，形成硅胶糊状混合物。

21、进一步，步骤(2)中所述的流动相配制方法如下：将正己烷、乙酸乙酯、乙腈和冰醋酸按体积比1：3：9：0.1的比例混合，所述的流动相的用量为240μl。

22、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种zif-67/ag nps/au nws三元复合材料的制备方法及其结合tlc-sers芯片定量检测环境中mc-lr含量的方法，首先，我们提出了一种新型的复合sres衬底，即在原位合成的2d-zif-67上覆盖预先支撑ag nps的aunws形成zif-67/ag nps/au nws三元复合材料sers基底。其中，au nws使ag nps的分布更加均匀，而形成的双金属结构也保持了恒定的间隙，从而使电磁"热点"更加均匀。ag nps/aunws结构可以为em效应提供丰富的尖端和相应的“热点”，并通过刷状结构实现分子的富集，最终有助于更好地增强sers检测；此外，zif-67层的加入主要是促进电荷转移，产生cm增强，且由于其独特的纳米片结构，能更好地暴露可用的活性节点，同时保留更大的吸附表面积，从而具有更强的吸附和分离性能，并有利于与金属结构相结合，进一步稳定了ag nps/au nws的表观形态结构和氧化活性，并产生了导致更强sers响应的cm效应。因此，zif-67/ag nps/au nws三元复合材料能提供最佳sers性能。

23、其次，采用传统的薄层色谱(tlc)技术和新型的表面增强拉曼散射(sers)基底，制作了一种tlc-sers芯片，用于复杂样品中mc-lr的纯化和定量检测。薄层色谱技术具有纯化和富集能力，可以将被测对象从食品的复杂组分中提取，进行分离纯化后富集。通过将关键单元集成在tlc-sers芯片上，既经济又简便地实现了组合，通过tlc的层析过程，有效地富集了特定拉曼增强波段上的mc-lr分子浓度，并去除杂质和污染物，防止干扰和削弱最终的sers光谱使灵敏度达2.27×10-9mm，成功捕捉和测定样品中的痕量mc-lr。使用tcl-sers组合的方法，既能够提升检测mc-lr的精准度，又可以提高对mc-lr的检测效率，大大缩短了检测时间，非常适用于食品现场监管场景。

24、综上所述，本发明基于zif-67/ag nps/au nws三元复合材料的强大sers性能和tcl技术的富集和纯化能力，制作的一种tlc-sers芯片与sers方法结合，建立了一种简单、快速、灵敏度高的mc-lr定量分析方法。该方法可用于检测各类养殖水产品是否受到mc-lr污染以及监测在售水产品是否安全合格。