一种广谱型细菌选择性核酸探针及其应用

本发明涉及精细化工，具体涉及一种广谱型细菌选择性核酸探针和应用，尤其涉及细菌选择性核酸探针在细菌特异性成像方面的应用。

背景技术：

1、细菌构成了我们体内和周围的微生物生态系统，也存在于环境中，具有丰富的多样性和复杂性，与人类的疾病和死亡密切相关。细菌在适宜条件下可快速繁殖，致病性菌株威胁公共卫生，可引起大规模传染病。因此，细菌的高效检测对公共卫生安全具有重要意义。细菌的选择性通常是由细胞表面成分介导的，存在于整个细菌细胞膜上的肽聚糖、脂多糖、胞壁酸等都可作为生物识别的靶点。细菌细胞膜的主要成分是带负电荷的磷脂，包括磷脂酰甘油和心磷脂。革兰阴性菌外膜上的磷脂酰甘油和心磷脂以及细胞壁上的脂多糖均使细菌的整个表面带负电荷；革兰氏阳性菌没有外膜，嵌入细胞壁的磷壁酸也显示出负电荷。探针分子通过与细菌之间静电和疏水相互作用产生的荧光信号，从而实现对细菌的非特异性检测。核酸是细菌不可或缺的组成成分，也是有机小分子荧光探针的重要靶点。但是由于革兰氏阴性菌外膜的存在，导致探针分子很难进入革兰氏阴性菌内部并与核酸结合，因此大多数的核酸探针分子只能检测革兰氏阳性菌，缺少对广谱细菌活性检测的有机小分子核酸探针。syto 9是唯一的商业化细菌活性检测核酸探针，但存在毒性大，抑制细菌生长，不适合长时间成像。此外，由于细菌与细胞膜结构的相似性，只染色细菌而不染色细胞的有机小分子核酸探针目前未见报道。

技术实现思路

1、基于以上现存技术的缺陷，本发明公开了一种广谱型细菌选择性核酸探针及其应用，其第一个目的是开发一种高生物相容性的广谱型细菌选择性核酸探针。噻唑橙染料存有正电荷，更容易靶向细菌带有带负电的细菌膜表面；分子量小更容易进入细菌内；分子结构易于修饰的优点，适宜开发细菌选择性核酸探针。更进一步，本发明的第二个目的是开发具有高特异性细菌成像的核酸探针，能够只染色细菌而不染色细胞，用于细菌感染的原位检测。最后，本发明的第三个目的是将开发的细菌选择性核酸探针同商业化死细胞核酸pi染料联用，用于细菌活性检测。

2、本发明核酸探针对核酸具有良好的响应，响应时间快速，且细胞毒性低，生物相容性优良。更进一步，该探针能够选择性进入细菌内部，同核酸结合后产生荧光信号，而不进入细胞内部，可应用于细菌感染的原位检测，更进一步，该核酸探针能够同pi染料联用，用于细菌活性检测。

3、本发明第一方面提供了一种广谱型细菌选择性核酸探针，具有如下结构通式：

4、

5、其中，r1选自氢原子、c1-c18烷基、苯基、or4或卤素；更为优选的情况下，r1选自氢原子或甲基；

6、r2或r3各自独立地选自c1-c18烷基、c1-c18羧基、c1-c18羟基、c1-c18nr5r6、苄基或取代苄基，其中取代苄基的取代基选自c1-c8烷基、c1-c8羧基、c1-c8羟基、c1-c18nr5r6、cn、nh2、no2、oh、sh、卤素或c1-c8卤代烷基；更为优选的情况下，r2选自甲基、苄基、3-羟基丙基、4-(二乙基氨基)丁基中的一种；更为优选的情况下，r3选自甲基、3-羟基丙基、5-羧基戊基中的一种；

7、x—选自卤素负离子、clo4-、pf6-、bf4-、ch3coo-或ots-中的一种；更为优选的情况下，x—选自卤素负离子或pf6-中的一种；

8、r4、r5和r6各自独立地选自h或者c1-18烷基，更为优选的情况下，r4、r5和r6各自独立地选自h或者c1-8烷基。

9、对于上文所述的技术方案，更进一步，所述的广谱型细菌选择性核酸探针结构如下所示；

10、

11、

12、本发明第二方面提供了所述广谱型细菌选择性核酸探针在非疾病诊断和治疗方面的应用。

13、对于上文所述的技术方案，更进一步，所述应用包括在特异性细菌成像、细菌的高灵敏度原位成像与活性诊断、细菌活性检测方面的应用，为多领域细菌检测提供先进工具。

14、其中，所述探针有效区分细菌与细胞，仅针对细菌产生特异性荧光信号，适用于复杂样本中的细菌原位快速识别。

15、对于上文所述的技术方案，更进一步，所述应用还包括：将所述探针与pi染料联用的新策略，推进了细菌活性检测的准确性与速度，通过荧光信号强度变化直观反映细菌生存状态。

16、对于上文所述的技术方案，更进一步，所述探针与pi染料联用策略为将等摩尔比的上述探针与商用pi染料共同滴加到细菌感染部位，孵育10min后通过共聚焦显微镜对细菌感染部位进行荧光成像。联用时，所述核酸探针在细菌出现部分失活时，荧光出现减弱，pi染料的红色荧光逐渐增加，对细菌活性检测快速精准。

17、具体而言，本发明的核酸探针在噻唑橙染料母体上引入不同亲水基团进行分子调控，保留了探针对核酸的特异性响应。此外分子的吸收和发射波长位于蓝、绿光波长范围(450-550nm)，低波长吸收表明分子存在高信噪比特点。此外，这些探针在细菌存在时，能够穿透细菌壁膜，而不穿透细胞膜，选择性地与细菌内核酸结合并发出荧光，即便在细菌与细胞共存环境中也能准确成像。在细菌活性检测应用上，当细菌活力下降时，核酸探针的荧光减弱而pi染料的红色荧光增强，二者协同作用，为用户提供了一种直观、高效的细菌存活状态评估方法，适用于科研及多个实际应用场景中的细菌感染和细菌活性快速筛查。

18、本发明所述的广谱型细菌选择性核酸探针制备方法，包括以下步骤：

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20、s1：中间化合物ⅲ的合成

21、2-甲基苯并噻唑或2,6-二甲基苯并噻唑和卤代烷按照摩尔比为1：2～5反应得到中间化合物ⅲ；

22、s2：中间化合物ⅱ的合成

23、4-碘吡啶和卤代烷按照摩尔比为1：2～5反应得到中间化合物ⅱ；

24、s3：核酸探针ⅰ的合成

25、中间化合物ⅲ和中间化合物ⅱ按照摩尔比为1：1.2～1.5反应。反应结束后将反应液加入乙醚，抽滤得固体沉淀，经硅胶柱层析纯化(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1；v/v)得核酸探针ⅰ。

26、本发明上述的制备方法中溶剂最优均为除水溶剂；

27、本发明上述的制备方法中提纯方法均采用常规方法，没有特别限制，优选二氯甲烷、甲醇作为洗脱剂色谱柱分离、重结晶或两者结合。

28、本发明的有益效果：

29、第一、本发明对核酸具有良好的响应性。

30、第二、本发明具有高信噪比，减少背景干扰，且生物相容性良好，快速响应的特点。

31、第三、本发明能够对细菌进行特异性成像，在细菌和细胞共存时，能够特异性成像细菌，而细胞几乎不存在荧光，对比度高，成像清晰。

32、第四、本发明能够将核酸探针应用于小鼠眼球细菌感染的原位检测，且成像效果明显。相比于styo 9，所述核酸探针能够特异性识别细菌原位感染区域，且具有普适性。

33、第五、本发明能够将所述核酸探针同pi染料联用，用于细菌活性检测，将pi染料和所述核酸探针联用能够区分活细菌、部分失活细菌以及死细菌，区分度良好，检测时间快速。