一种试剂盒及其在诱导hUCMSC成软骨分化中的用途的制作方法

本发明涉及试剂盒，具体为一种试剂盒及其在诱导hucmsc成软骨分化中的用途。

背景技术：

1、软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，被包裹于主要成分为胶原纤维、蛋白聚糖和水的细胞外基质组成的无神经、无血管和无淋巴管结构中，修复能力差且更新缓慢，因此，软骨细胞的表型稳定、合成代谢/分解代谢平衡和存活对于维持正常的关节软骨至关重要，增龄、病理环境和生物力学因素导致的软骨细胞代谢紊乱或死亡使软骨基质降解-再生失调，进而导致关节软骨退行性疾病，其范围从孤立的关节软骨缺损到终末期骨关节炎，严重者可致残，关节软骨是无血管组织，药物难以通过关节表面扩散至软骨细胞，因此软骨损伤的药物治疗以对症治疗为主，不能延缓或逆转关节的进行性退变，目前的外科修复技术，如微骨折和半月板植入术常导致缺乏透明软骨力学性能的纤维软骨形成，使受损软骨无法完全恢复，常需进行二次手术。自体软骨细胞移植是美国批准的一种用于修复软骨的细胞治疗方法，目前已成为治疗大段软骨损伤的金标准，但由于供区并发症和软骨细胞的体外增殖能力有限和易肥大，以及治疗后纤维软骨形成，该治疗方法存在局限性，因此迫切需要寻找用于关节软骨损伤修复的种子细胞。

2、间充质干细胞具有成软骨分化潜能，且具有易获取性和可增殖性，可用于替代退变或死亡的软骨细胞，进而发挥软骨修复作用，有望成为软骨损伤的新细胞治疗手段。

3、但是，传统的治疗手段存在以下缺点：

4、目前，诱导mscs成软骨分化多采用含转化生长因子β、骨形态发生蛋白和地塞米松的成软骨诱导培养基，tgf-β和bmp是mscs成软骨分化的强效诱导因子，地塞米松常作为tgf-β或bmp的补充，促进细胞增殖和分化，但此常规诱导方式易导致非预期的纤维软骨细胞表型和肥大细胞表型，纤维软骨细胞表型高表达ⅰ型胶原，促进纤维软骨形成；肥大软骨细胞表型高表达ⅹ型胶原和碱性磷酸酶，导致血管侵袭和软骨内骨生成，两者均可引发关节僵硬和疼痛。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种试剂盒及其在诱导hucmsc成软骨分化中的用途，以解决上述背景技术中提出的目前，诱导mscs成软骨分化多采用含转化生长因子β、骨形态发生蛋白和地塞米松的成软骨诱导培养基，tgf-β和bmp是mscs成软骨分化的强效诱导因子，地塞米松常作为tgf-β或bmp的补充，促进细胞增殖和分化，但此常规诱导方式易导致非预期的纤维软骨细胞表型和肥大细胞表型，纤维软骨细胞表型高表达ⅰ型胶原，促进纤维软骨形成；肥大软骨细胞表型高表达ⅹ型胶原和碱性磷酸酶，导致血管侵袭和软骨内骨生成，两者均可引发关节僵硬和疼痛的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种试剂盒，包括试剂盒本体，所述试剂盒本体包括成软骨分化基础培养基、第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂、泊洛沙姆407和透明质酸。

3、作为本发明的一种优选技术方案，所述成软骨分化基础培养基包括高糖dmem/f12、1％its+premix、100μg/ml丙酮酸钠、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸、40μg/ml脯氨酸。

4、作为本发明的一种优选技术方案，所述1％its+premix包括胰岛素-转铁蛋白-硒、6.25mg/ml胰岛素、6.25mg/ml转铁蛋白、6.25mg/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35mg/ml亚油酸。

5、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一成软骨分化培养添加剂包括高糖dmem/f12、500ng/ml重组人tgf-β3、5mm地塞米松和5μg/ml bmp-7。

6、作为本发明的一种优选技术方案，所述第二成软骨分化培养添加剂包括高糖dmem/f12、5μm环黄芪醇和5μg/ml人甲状旁腺素相关蛋白1-34。

7、作为本发明的一种优选技术方案，所述第一成软骨分化培养添加剂的浓缩倍数为50。

8、作为本发明的一种优选技术方案，所述第二成软骨分化培养添加剂的浓缩倍数为50。

9、本发明一种试剂盒在诱导hucmsc成软骨分化中的用途，所述试剂盒本体试剂盒促进hucmsc成软骨分化并维持软骨细胞表型。

10、作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒本体的使用步骤如下：s1、制备泊洛沙姆407：将泊洛沙姆407添加到注射用水(4-8℃)中，混匀后于4-8℃溶胀24-36h，制备成质量分数为20％(w/w)的p407水溶液；s2、制备凝胶溶液：在泊洛沙姆407水溶液中于4-8℃下加入质量分数为1％(w/w)的透明质酸，缓慢搅拌2h，作为泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶溶液备用；s3、溶液促凝：按1×106个/cm3将hucmsc均匀加至泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶溶液(4-8℃)中，将hucmsc-泊洛沙姆407-透明质酸混合物转移至细胞培养板或聚丙烯锥形管中，置于37℃的培养箱中促凝，s4、稀释添加剂：在4℃条件下将-20℃以下冻存的第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂解冻，用成软骨分化基础培养基将解冻后的第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂稀释50倍；s5、细胞培养：将含第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂的培养基加入胶凝后的hucmsc-泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养28天，期间每3天更换1次培养基，换液时避免破坏细胞团。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、1、采用本试剂盒诱导的hucmsc成软骨分化，与常规成软骨诱导培养基相比，在分化中期(14天)和晚期(28天)均提高了蛋白聚糖和ⅱ型胶原含量，降低了ⅰ型胶原、ⅹ型胶原和alp含量，表明成功诱导hucmsc向稳定的软骨细胞分化并分泌更接近透明软骨的ecm，满足软骨组织工程的要求，用于hucmsc来源的软骨细胞产业化制备；

13、2、人脐带间充质干细胞是来源最广泛，体外扩增潜能最大的，最适于制备药用msc库的细胞类型，该试剂盒促进hucmsc成软骨分化并维持软骨细胞表型，有望用于制备临床级hucmsc来源的软骨组织工程产品。

技术特征：

1.一种试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于：所述试剂盒本体包括成软骨分化基础培养基、第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂、泊洛沙姆407和透明质酸。

2.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述成软骨分化基础培养基包括高糖dmem/f12、1％its+premix、100μg/ml丙酮酸钠、50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸、40μg/ml脯氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述1％its+premix包括胰岛素-转铁蛋白-硒、6.25mg/ml胰岛素、6.25mg/ml转铁蛋白、6.25mg/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35mg/ml亚油酸。

4.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述第一成软骨分化培养添加剂包括高糖dmem/f12、500ng/ml重组人tgf-β3、5mm地塞米松和5μg/ml bmp-7。

5.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述第二成软骨分化培养添加剂包括高糖dmem/f12、5μm环黄芪醇和5μg/ml人甲状旁腺素相关蛋白1-34。

6.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述第一成软骨分化培养添加剂的浓缩倍数为50。

7.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于：所述第二成软骨分化培养添加剂的浓缩倍数为50。

8.根据权利要求1-7任一所述的一种试剂盒在诱导hucmsc成软骨分化中的用途，其特征在于：所述试剂盒本体试剂盒促进hucmsc成软骨分化并维持软骨细胞表型。

9.根据权利要求8所述的一种试剂盒在诱导hucmsc成软骨分化中的用途，其特征在于：所述试剂盒本体的使用步骤如下：s1、制备泊洛沙姆407：将泊洛沙姆407添加到注射用水(4-8℃)中，混匀后于4-8℃溶胀24-36h，制备成质量分数为20％(w/w)的p407水溶液；s2、制备凝胶溶液：在泊洛沙姆407水溶液中于4-8℃下加入质量分数为1％(w/w)的透明质酸，缓慢搅拌2h，作为泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶溶液备用；s3、溶液促凝：按1×106个/cm3将hucmsc均匀加至泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶溶液(4-8℃)中，将hucmsc-泊洛沙姆407-透明质酸混合物转移至细胞培养板或聚丙烯锥形管中，置于37℃的培养箱中促凝，s4、稀释添加剂：在4℃条件下将-20℃以下冻存的第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂解冻，用成软骨分化基础培养基将解冻后的第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂稀释50倍；s5、细胞培养：将含第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂的培养基加入胶凝后的hucmsc-泊洛沙姆407-透明质酸水凝胶中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养28天，期间每3天更换1次培养基，换液时避免破坏细胞团。

技术总结本发明公开了一种试剂盒及其在诱导hUCMSC成软骨分化中的用途，包括试剂盒本体，试剂盒本体包括成软骨分化基础培养基、第一成软骨分化培养添加剂、第二成软骨分化培养添加剂、泊洛沙姆407和透明质酸，本发明采用本试剂盒诱导的hUCMSC成软骨分化，与常规成软骨诱导培养基相比，在分化中期和晚期均提高了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原含量，降低了Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原和ALP含量，表明成功诱导hUCMSC向稳定的软骨细胞分化并分泌更接近透明软骨的ECM，满足软骨组织工程的要求，用于hUCMSC来源的软骨细胞产业化制备；人脐带间充质干细胞是来源最广泛，体外扩增潜能最大的，最适于制备药用MSC库的细胞类型。技术研发人员：苑春慧,谢广宝受保护的技术使用者：北京再生生物科技研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/21