益气解毒化瘀方在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用

本发明涉及糖尿病肾病防治，更具体地说，它涉及益气解毒化瘀方在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。

背景技术：

1、糖尿病肾病(diabetic kidney disease,dkd)是导致t2dm高死亡率的主要因素。dkd已成为慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因。t2dm患者终末期肾病风险比为2.32(95％ci2.30-2.35)。糖尿病可通过多种途径损害肾脏多个部位。dkd是糖尿病最主要的微血管并发症，是糖代谢异常引起肾脏结构和功能改变，dkd典型的病理特点为肾小球肥大、肾小球纤维化及肾小管萎缩、肾小管间质纤维化。目前dkd的治疗仍局限于控制血糖、血压，阻断钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂、肾素-血管紧张素系统等，治疗效果尚不理想。因此，阐明dkd发病机制、探究防治dkd的有效方法已经成为研究的热点。近年来越来越多研究支持dkd肾损伤早期可出现肾小管间质纤维化。肾小管上皮细胞富含线粒体，线粒体功能正常与否直接影响肾小管上皮细胞的功能。多项研究证实肾小管损伤在dkd发病过程中发挥重要作用,肾小管上皮细胞损伤可诱导炎症因子分泌，导致间质炎症,抑制肾小管上皮细胞炎症损伤是防治dkd的重要途径。

2、线粒体自噬与糖尿病肾脏疾病

3、肾脏中含有丰富的线粒体，线粒体功能障碍在dkd发病机制具有重要作用。线粒体自噬是一种选择性自噬，通过特异性清除受损老化的线粒体，减少细胞内的ros，维持稳态。pten诱导的蛋白激酶1(pten induced putative kinase1,pink1)/parkin通路和线粒体自噬受体信号通路介导为线粒体自噬的经典模式，磷酸腺苷激活的蛋白激酶(amp-activatedprotein kinase,ampk)为线粒体代谢和线粒体自噬的关键参与者。线粒体自噬过度或线粒体自噬障碍诱发细胞能量代谢紊乱，加重细胞凋亡。在dm早期高血糖状态下肾脏可能通过诱导线粒体自噬清除损伤的线粒体，维持功能稳定。在持续高血糖状态下，线粒体自噬反应减弱，细胞内ros过量产生、加快线粒体片段化及细胞凋亡，导致内皮损伤、足细胞骨架的重组、系膜扩张，滤过屏障被破坏导致蛋白尿的出现。pink 1通过磷酸化parkin促迚其由细胞质到线粒体转位，使parkin在线粒体外膜聚集，促进泛素链生成，自噬调节蛋白p62不损伤线粒体结合，p62微管相关蛋白l轻链-3ⅱ(lc-3ⅱ)结合使损伤的线粒体被自噬体吞噬，被溶酶体降解。细胞膜电位持续降低，提供自噬信号，引起线粒体自噬紊乱。线粒体裂变过多是dm肾脏中线粒体功能障碍的重要特征。ampk为细胞能量传感器，是线粒体生物发生的关键调节剂，ampk激活将促进线粒体自噬。ampk与下游分子协同作用在线粒体自噬中发挥着重要作用。有研究表明肾小管损伤可能与线粒体自噬异常有关，ampk激动剂二甲双胍对肾小管细胞线粒体自噬和细胞损伤的影响，采用高脂饮食和stz诱导的dm小鼠模型和hk-2细胞。研究发现p-ampk、pink1、parkin、lc3ii和atg5在糖尿病小鼠肾组织中的表达明显降低。zhanm等研究发现dkd大鼠的肾小球足细胞中有明显的线粒体片段堆积，同时伴随p62表达水平增高，lc-3ⅱ表达水平下降，提示自噬体清除障碍。在dm小鼠的肾脏和高糖刺激的肾小管上皮细胞中，线粒体自噬明显减弱，与pink/parkin信号通路密切相关。dn晚期，肾小管间质、肾小球的损伤形成纤维化，线粒体自噬与纤维化过程中细胞凋亡、炎性细胞浸润和氧化应激等机制的失衡有关。

4、sirt1-线粒体自噬

5、沉默信息调节因子sir1(silent information regulator1,sirt1)基因家族是一类nad+依赖型去乙酰化酶，sirt1能调节组蛋白去乙酰化，通过表观遗传修饰调节转录因子活性。高血糖状态下sirt1表达受到抑制，增加氧化应激并触发足细胞损伤。研究表明sirt1激活可通过抑制炎症、氧化应激、肾纤维化、细胞凋亡，促进自噬，稳定线粒体功能以改善dkd，减轻肾损伤。sirt1可以去乙酰化和激活lkb1，活化的lkb1促进ampk磷酸化，sirt1可通过lkb1-ampk信号通路激活自噬，以减轻高脂高糖诱导的内皮细胞损伤。研究表明sirt1过表达组较模型组sirt1、parkin、sirt3、lc3ⅱ/ⅰ等蛋白表达水平升高，肾间质α-sma阳性细胞数减少，肾脏病理改变减轻；sirt1/sirt3信号轴保护糖尿病大鼠肾脏功能的机制可能为通过改善线粒体自噬，减轻肾小管-间质损伤。

6、sirt1-foxo1信号通路调控自噬

7、sirt1-foxo1-自噬通路对糖尿病、肥胖等具有重要影响。foxo转录因子是一类关键的自噬调控因子，以foxo1的作用最为广泛。sirt1可通过促进foxo1的去乙酰化来调节foxo1的活性，从而调控自噬的发生。foxo1可通过激活细胞自噬活性，在肾脏、肝脏、心脏、血管、骨骼肌等多种器官或组织中，参与调节细胞增殖、代谢、存活等过程；sirt1-foxo1自噬途径可能在dm发病机制中发挥重要作用。可以通过调节骨骼肌中的sirt1-foxo1信号通路和改善脂质代谢来增加自噬水平。研究表明，sirt1可以使叉头框蛋白3(forkhead boxprotein 3，foxo3)去乙酰化，而foxo3可增加自噬相关蛋白bnip3、nix的表达及lc3ii/i的比值，进而诱导线粒体自噬。研究表明益气解毒通络类方药可以通过调节zdf大鼠sirt1-foxo1自噬途径相关的基因来降低ir。观察到sirt1作为上游基因可抑制foxo1的活性，促进自噬相关因子lc3的表达，增加自噬活性，减少胰腺脂质异位沉积，调节脂质代谢，缓解胰岛素抵抗。益气解毒通络类方药对sirt1-foxo1通路的调控作用与sirt1过表达相似，调控sirt1-foxo1信号通路增加胰腺β细胞的自噬活性，以降低胰岛素抵抗并治疗t2dm。因此，sirt1-foxo1自噬途径可能在胰岛素抵抗和dm、dkd的发病机制中起重要作用。有学者建立了高脂饮食和低剂量链脲佐菌素诱导的dm大鼠模型及高糖培养大鼠系膜细胞，并检测氧化应激和自噬相关因子。研究表明foxo1下调与丙二醛(mda)生成的增加，sod活性的降低以及dm大鼠肾皮质中胶原蛋白iv和纤连蛋白表达的增加相关。应用sirtuin激动剂白藜芦醇治疗，sirt1表达增加，显著增加糖尿病肾脏中的foxo1活性。白藜芦醇能减少mda生成，增加sod活性，改善dkd肾脏病理和生化指标。综上，表明调控sirt1/foxo1通路可能是防治dkd的潜在靶点。项目组前期对dkd及sirt1通路相关分子进行研究，发现zdf糖尿病模型大鼠sirt1表达明显降低，p-ampk表达明显降低。sirt1过表达可减轻肾小管损伤，p-ampk表达明显增加，lc3ii/i的比值增加，drp-1蛋白表达降低。由此推测，sirt1的激活可以通过不同途径调控线粒体自噬和动力学平衡对糖尿病肾小管损伤起保护作用。

8、自噬-nlrp3炎性体途径与dkd发病机制相关研究

9、nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,nlrp3)nlrp3炎症小体的异常激活与糖尿病等多种炎症性疾病发病机制有关。微炎症状态在dkd进展中起关键作用，持续高血糖刺激、血管紧张素系统激活以及氧化应激等均可导致肾脏炎性细胞浸润，诱导肾脏纤维化。通过激活nlrp3蛋白寡聚化从而产生炎症小体，进而引起细胞线粒体损伤和ros的产生，活化炎症因子，引起炎症反应。abdel-khaliksr等研究表明znonps调节自噬蛋白，激活大鼠肾脏足细胞自噬，通过下调nlrp3表达和降低il-1β水平来改善ages水平，增强自噬活性并减弱炎症小体活化。znonps通过自噬和nrf2/txnip/nlrp3炎症小体信号传导之间的相互作用延缓dkd进展。炎症小体和细胞自噬在功能上相互关联，均与细胞新陈代谢、能量产生和细胞器维持相关，能调控炎症和病原体的清除。houy等[28]研究表明nlrp3是自噬的负调节因子，并表明在高糖下通过nlrp3的失活恢复足细胞自噬可以减少足细胞损伤。因此，调控线粒体自噬、抑制炎症小体活化和细胞凋亡激活，减轻肾组织损伤可能成为治疗dkd的新方法。

10、中医药对dkd病因病机的认识

11、dm患者伤阴耗气，久病入络，在气阴两虚或阴阳两虚基础上，内热、痰湿、气滞、血瘀胶结，形成瘀血阻络。dkd患者肾脏组织结节、硬化等病理改变与瘀血阻络病机相似，气虚推动无力既会引起络瘀,同时引起津液代谢失常而表现为水停。其气虚络瘀为病因、瘀水互结为特点。提示dkd基本病机是本虚标实，脾肾等脏腑功能失调是其根本，正气亏损，气阴两虚是其物质基础；标实以瘀血阻络为主，瘀血、痰浊相互搏结是瘀血难化的关键，dkd核心病机为气虚、燥热、瘀血、浊毒。

12、dkd患者脏腑功能失常，气化不利，血行不畅，导致津液输布障碍，出现小便不利、蛋白尿、水肿等症状表现，治疗当以益气化瘀利水为主。益气解毒化瘀方由水蛭、三七、金银花、当归、黄连、黄芪、玄参、葛根、甘草、苍术、厚朴组成。本方以水蛭、三七、金银花、当归入血分，活血化瘀共为君药，水蛭素具有抗凝、抗纤维化、降血脂、改善血液流变学、促进微血管生成、等药理作用。三七的主要成分为三七总皂苷具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、改善微循环等药理作用。金银花具有抗炎、抗氧化、降血糖等药理作用。黄芪、葛根健脾益气、输布津液；黄连、玄参清热凉血，泻火解毒；苍术、厚朴燥湿运脾、调畅气机；全方共奏益气解毒、化瘀通络之效，通过化瘀治血以治水，切合dkd水血同病的核心病机，久病气虚燥热、浊毒瘀血相互为虐的病机。

13、益气解毒化瘀方抑制炎症因子激活表达，阻碍炎症通路，延缓肾小管-间质纤维化。可能通过激活sirt1/ampk通路，调节自噬，保护大鼠肾脏组织；下调tgf-β1、α-sma表达、上调e-cadherin表达，减少肾间质纤维化，缓解肾损伤。黄芪甲苷通过调控sirt1/nf-κb信号通路抑制炎症，改善高糖条件下nrk-52e细胞上皮-间充质转化，改善dkd大鼠肾间质纤维化。应用高糖诱导小鼠肾足细胞mpc5建立足细胞损伤模型，葛根素通过上调mir-30e-5p表达抑制高糖诱导足细胞凋亡，减少ros生成，缓解氧化应激与线粒体损伤。ampk/sirt1通路是细胞内重要的抗氧化通路，ampk和sirt1协同作用通过foxo1介导的氧化应激和自噬调节糖尿病肾脏损伤。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供益气解毒化瘀方在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用，通过动物从组织、蛋白、基因多层次探究益气解毒化瘀方通过激活ampk/sirt1-foxo1介导线粒体自噬通路，调控nlrp3炎性小体，为防治dkd提供新靶点。

2、本发明的益气解毒化瘀方通过抑制肾小管上皮细胞线粒体自噬及炎性小体炎症损伤防治dkd。益气解毒化瘀方防治dkd肾小管损伤的机制为：激活ampk/sirt1-foxo1介导线粒体自噬通路及炎性小体相关分子，靶向调节自噬参与肾小管上皮细胞的炎症反应，延缓dkd进展。

3、综上所述，本发明具有以下有益效果：

4、(1)本发明在中医药“水血同病”理论的指导下，从dkd发病机制入手，基于肾小管线粒体自噬及炎性小体炎性反应在dkd发病作用机制的新视角，为应用益气解毒化瘀方理论防治dkd提供证据。

5、(2)本发明证实益气解毒化瘀方有效改善肾纤维化病理状态，显著改善肾小管萎缩。益气解毒化瘀方通过激活ampk、sirt1基因及蛋白表达，抑制nlrp3炎性小体相关基因转录及蛋白表达，减轻线粒体自噬与细胞凋亡修复血管内皮功能，缓解糖尿病肾损伤。

6、(3)本发明从整体动物实验水平，组织、蛋白、基因水平多层次，阐明益气解毒化瘀方是否通过调控“ampk/sirt1-foxo1线粒体自噬通路，激活线粒体自噬，恢复线粒体稳态及调控肾小管炎症小体；证实srit1对自噬小体、炎症小体的靶向调节作用，阐明益气解毒化瘀方防治dkd机制，多靶点保护dkd大鼠肾脏功能，为防治dkd提供理论和实验基础。