一种用于生产L-高丝氨酸的无营养缺陷无质粒的重组大肠杆菌及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种用于生产l-高丝氨酸的无营养缺陷无质粒的重组大肠杆菌及其应用。

背景技术：

1、l-高丝氨酸是一种重要的平台化合物，不仅可以用于合成l-蛋氨酸，还可以用作合成精胺的前体。l-高丝氨酸也被用于合成除草剂精草铵膦（l-草铵膦）。

2、l-高丝氨酸是细胞合成l-甲硫氨酸、l-赖氨酸、l-苏氨酸的重要前体。为提升高丝氨酸的生产水平，现有的l-高丝氨酸生产菌株多采用阻断这三种氨基酸合成的策略。因此，生产菌株多为这三种氨基酸的缺陷型，发酵过程中需要外源添加这三种氨基酸。而这三种氨基酸的价格高昂，是降低l-高丝氨酸生产成本的重要阻碍。

3、编码具有l-天冬氨酸激酶和l-高丝氨酸脱氢酶活性蛋白的 thra* 基因是l-高丝氨酸合成途径中重要的酶。现有生产菌株对这一基因往往采用质粒表达或者基因组多拷贝整合的策略来提升该基因的转录水平，进而提升该蛋白的表达水平。而转录过程是细胞生命活动中内最为耗能的过程，堆砌转录水平的强度一方面效果往往不尽人意，另一方面不利于细胞转化率的提升。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于生产l-高丝氨酸的无营养缺陷无质粒的重组大肠杆菌及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种用于发酵生产l-高丝氨酸的重组菌。

3、本发明要求保护的用于发酵生产l-高丝氨酸的重组菌，为如下任一：

4、（a1）在底盘宿主菌的基因组中插入 thra*基因表达盒后所得；在所述 thra*基因表达盒中， thra*基因的5’非翻译区序列为seq id no.1；

5、（a2）将底盘宿主菌的基因组 thra*基因的5’非翻译区序列替换为seq id no.1后所得；

6、所述底盘宿主菌为大肠杆菌。

7、在（a1）中，所述 thra*基因表达盒可被插入到所述底盘宿主菌基因组中结构基因的间隔区等位置，原则是不影响基因组上其他基因的表达。

8、在本发明的一个实施案例中，所述 thra*基因表达盒被插入到所述底盘宿主菌基因组中的 frwa_frwc位点。所述 frwa_frwc位点为大肠杆菌基因组中 frwa基因（gene id:948437）和 frwc基因（gene id: 948448）之间的间隔区。所述 frwa_frwc位点的上游同源臂序列如seq id no.6的第1-500位；所述 frwa_frwc位点的下游同源臂序列如seq id no.6的第3379-3878位。

9、所述 frwa_frwc位点参见“anke r goormans et al. comprehensive studyon escherichia coligenomic expression: does position really matter? metab eng.2020 nov:62:10-19. doi: 10.1016/j.ymben.2020.07.007. epub 2020 aug 11.”一文。

10、进一步地，所述 thra*基因的核苷酸序列如seq id no.6的第679-3141位所示。

11、更进一步地，在（a1）中，在所述 thra*基因表达盒中，驱动所述 thra*基因转录的启动子为p119启动子；更进一步地，所述p119启动子的核苷酸序列如seq id no.6的第563-597位所示。更加具体地，所述 thra*基因表达盒的核苷酸序列如seq id no.6的第563-3141位所示（对应p119-2f-1- thra*）。

12、进一步地，所述底盘宿主菌保留了l-甲硫氨酸和l-赖氨酸两种氨基酸合成途径，并且弱化了l-苏氨酸合成途径。

13、进一步地，所述底盘宿主菌的基因型为 e.colibw25113/f’ δthrl:: pfliaδ laciδ stha::ptac- pntabδ ldhaδ poxbδ pflbδ flik::ptac-rhtbδ yeej::p119-rhtbδ ptsg::p119-glkδ galr::p119-zglfδ ompt::ptac-ppcδ iclrδ yjiv::ptac- aspc-gdha  δprhta::ptac。

14、在本发明的一个实施案例中，所述底盘宿主菌为对大肠杆菌hs18m进行如下改造后得到的：a1）原位回补蛋氨酸代谢旁路高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的编码基因；a2）原位回补赖氨酸代谢旁路二氨基庚酸脱羧酶lysa的编码基因；a3）使用弱启动子驱动回补高丝氨酸激酶thrb的编码基因。所述大肠杆菌hs18m为去除了大肠杆菌hs18中的质粒ps95s-t hra*-asd-aspa-rbs2800后得到的菌株。

15、其中，所述高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的氨基酸序列为（genbank号及提交日aac76983.1，20180924），对应的编码基因序列为gene id: 948513。所述二氨基庚酸脱羧酶lysa的氨基酸序列为（genbank号及提交日np_417315.1，20181011），对应的编码基因序列为gene id: 947313。所述高丝氨酸激酶thrb的氨基酸序列为（genbank号及提交日：np_414544.1，20181011），对应的编码基因序列为gene id: 947498。

16、在a3）中，所述弱启动子可为任何能够在大肠杆菌中弱化 thrb基因表达的启动子。在本发明的一个具体实施案例中，所述弱启动子为pflia启动子（seq id no.3的第499-648位）。

17、在本发明的一个实施案例中，所述a1）、所述a2）和所述a3）均是通过crispr/cas9技术实现的。用于原位回所述高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的编码基因的打靶片段（donor片段）如seq id no.4所示。用于原位回补所述二氨基庚酸脱羧酶lysa的编码基因的打靶片段（donor片段）如seq id no.5所示。使用所述弱启动子驱动回补用于高丝氨酸激酶thrb的编码基因的打靶片段（donor片段）如seq id no.3所示。

18、进一步地，在所述底盘宿主菌的基因组中 frwa_frwc位点插入所述 thra*基因表达盒可通过crispr/cas9技术实现。在本发明的一个实施案例中，具体采用的打靶片段（donor片段）如seq id no.6所示。

19、第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的重组菌在发酵生产l-高丝氨酸中的应用。

20、第三方面，本发明要求保护一种制备前文第一方面中所述重组菌的方法。

21、本发明要求保护的制备前文第一方面中所述重组菌的方法，可包括如下任一步骤：

22、（b1）在前文第一方面中所述的底盘宿主菌的基因组中 frwa_frwc位点插入所述 thra* 基因表达盒；在所述 thra* 基因表达盒中， thra*基因的5’非翻译区序列为seq idno.1；

23、（b2）将前文第一方面中所述的底盘宿主菌的基因组中所述 thra*基因的5’非翻译区序列替换为seq id no.1。

24、在（b1）中，所述 thra*基因表达盒可被插入到所述底盘宿主菌基因组中结构基因的间隔区等位置，原则是不影响基因组上其他基因的表达。

25、在本发明的一个实施案例中，所述 thra*基因表达盒被插入到所述底盘宿主菌基因组中的 frwa_frwc位点。所述 frwa_frwc位点为大肠杆菌基因组中 frwa基因（gene id:948437）和 frwc基因（gene id: 948448）之间的间隔区。所述 frwa_frwc位点的上游同源臂序列如seq id no.6的第1-500位；所述 frwa_frwc位点的下游同源臂序列如seq id no.6的第3379-3878位。

26、所述 frwa_frwc位点参见“anke r goormans et al. comprehensive studyon escherichia coligenomic expression: does position really matter? metab eng.2020 nov:62:10-19. doi: 10.1016/j.ymben.2020.07.007. epub 2020 aug 11.”一文。

27、进一步地，（b1）中，在所述底盘宿主菌的基因组中所述 frwa_frwc位点插入所述 thra* 基因表达盒可通过crispr/cas9技术实现。在本发明的实施案例中，具体采用的打靶片段（donor片段）如seq id no.6所示。

28、第四方面，本发明要求保护一种发酵生产l-高丝氨酸的方法。

29、本发明要求保护的发酵生产l-高丝氨酸的方法，可包括如下步骤：发酵培养前文第一方面中所述重组菌，从发酵产物中获得l-高丝氨酸。

30、在本发明的一个实施案例中，对所述重组菌进行发酵培养时发酵培养基配方为：4g/l (nh4)2hpo4, 4g/l kh2po4,1.8g/l一水柠檬酸，2g/l 七水硫酸镁，5g/l酵母粉，20g/l一水葡萄糖。培养条件为：ph控制在6.8-7.2，溶氧控制在25%-30%，残糖控制在2g/l以下，补料瓶添加2g/l酵母粉。

31、第五方面，本发明要求保护dna分子。

32、本发明要求保护的dna分子，可为如下任一：

33、（c1）seq id no.1所示dna分子（对应实施例中的2f-1）；

34、（c2）seq id no.6的第599-3141位所示dna分子（对应实施例中的2f-1- thra*）；

35、（c3）seq id no.6的第563-3141位所示dna分子（对应实施例中的p119-2f-1- thra*）；

36、（c4）seq id no.6所示dna分子（用于在底盘宿主菌的基因组中 frwa_frwc位点插入p119-2f-1- thra*所用的打靶片段）。

37、第六方面，本发明要求保护含有前文第五方面中所述dna分子的表达盒或重组载体或重组菌。

38、第七方面，本发明要求保护前文第五方面中所述的dna分子或前文第六方面中所述的表达盒或重组载体在制备前文第一方面中所述重组菌中的应用。

39、本发明从mrna稳定性方面着手，兼顾核糖体结合效率，对 thra*基因的5’非翻译区进行了设计。实现了单拷贝整合与质粒表达相当的效果。获得的重组菌在48h发酵周期内生产了112.3g/l的l-高丝氨酸，其转化率达41g l-高丝氨酸/100g葡萄糖。本发明减少了基因组插入 thra*的拷贝数，有效提升了l-高丝氨酸的发酵生产效率。