一种牛月形单胞菌分离培养方法与流程

本发明属于微生物，具体地，涉及一种牛月形单胞菌分离培养方法。

背景技术：

1、反刍动物瘤胃微生物对饲料消化能力起决定性作用，介于对宿主的营养素供应影响其泌乳性能和饲料效率。牛月形单胞菌(selenomonas bovis)作为高饲料转化效率奶牛瘤胃中的基石微生物，可主导更高效的碳水化合物底物利用与代谢功能活性，是高效奶牛瘤胃菌群和功能调控的重要靶点微生物。牛月形单胞菌是月形单胞菌属的一种，是参与瘤胃发酵的重要细菌。其对反刍动物的生糖以及丙酸的生成起重要作用。利用多种宏组学联用技术系统研究，揭示了不同互作机制下的瘤胃微生态对奶牛饲料转化效率的影响；发现在高效动物瘤胃中，牛月形单胞菌的丰度上调4倍，并主导了几个产琥珀酸细菌的正向互作。此外，遗传学特性分析发现牛月形单胞菌为具有中等遗传力(遗传力为0.31)的可遗传瘤胃细菌，因其稳定的代际遗传特性而具有重要调控潜力，提示靶向调控瘤胃微生物牛月形单胞菌的丰度和功能可为精准调控反刍动物饲料转化效率提供新的可能。因此，分离筛选瘤胃丙酸生成菌-牛月形单胞菌对研究反刍动物瘤胃微生物丙酸代谢和调控提供理论基础，对牛月形单胞菌进行体外分离培养具有重要科学和生产意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种牛月形单胞菌分离培养方法，成功从奶牛瘤胃液中分离出牛月形单胞菌，该牛月形单胞菌可调节碳水化合物的趋化性，是高效奶牛瘤胃菌群和功能调控的重要靶点微生物。

2、本发明要解决的技术问题：开发瘤胃来源牛月形单胞菌的高效分离培养方法。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

4、一种牛月形单胞菌分离培养方法，包括以下步骤：

5、a1、基于瘤胃插管技术进行瘤胃液采集；

6、a2、培养前的材料制备与准备工作；

7、a3、牛月形单胞菌的分离；

8、a31、将瘤胃液于37℃迅速送回实验室在600r/min下离心10min，以去除瘤胃液中的饲料颗粒及纤毛虫等微生物，取上清液，用生理盐水梯度稀释，然后各取50μl不同梯度的稀释液用l棒均匀涂布于固体培养基中，在厌氧工作站或用厌氧培养袋在39℃条件下培养48h，取单个40μl菌落在新鲜lb固体培养基上划线，纯培养，并进行专性厌氧杆菌营养液的液体培养，在厌氧工作站中在37℃下恒温培养48h，再进行革兰氏染色镜检；

9、a32、称取pyg培养基基础18.04g，加热溶解于500ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min后，冷却至50℃，加入过滤除菌的维生素k1溶液0.5ml、血红素溶液(5mg/ml)2.5ml，以及25ml灭菌瘤胃液、25ml马血清和0.1gdtt，使用8m naoh将ph值调整至7.2，混匀备用；菌株保藏，将单个菌落接种于新鲜的液体全营养培养基，在厌氧培养箱(85％氮气、10％二氧化碳和5％氢气)中过夜，然后取菌液加入到灭菌甘油(浓度15％-20％)中，使用厌氧培养箱于37℃条件下培养48h，接着无菌条件下加入2ml细菌悬液至营养肉汤中，将细菌和肉汤混匀使细菌最终浓度为108-109cell/ml；基于冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管中，反复吹打，使珠子内部的气泡完全被细菌悬液替代，吸去冷冻管内多余的液体，将混有细菌和珠子的冷冻管放入-80℃冰箱保存；

10、a4、利用常规细菌接种法进行生化试验：以不同多糖(淀粉、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等)、二糖(纤维二糖、木二糖、甘露二糖等)或单糖(葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖)作为唯一碳源底物，进行bioscreen全自动微生物生长曲线分析以及生长动力参数分析，获得牛月形单胞菌可代谢的碳源底物谱，在此基础上对牛月形单胞菌所有可代谢碳源进行软琼脂平板趋化试验和毛细管趋化试验以测定细菌趋化性，确定使牛月形单胞菌产生正向趋化的特异性碳水化合物底物；

11、所述步骤a4中，毛细管趋化试验具体步骤为：

12、挑取单菌落培养至od600为0.1-0.2，将菌株使用趋化缓冲液(50mm磷酸钾缓冲液添加到20μm edta、0.05％甘油中，ph7.0)洗涤2次，在1200g下低速离心3min后，用相同缓冲液稀释至od600为0.05，然后将细菌悬液分装于96孔板；使用趋化缓冲液配制不同浓度的效应物分子-可代谢碳源底物，将毛细管一端热封，填充趋化缓冲液以及加入碳源底物效应物的趋化缓冲液，毛细管开放段浸于细菌悬液中，趋化30min后，将毛细管从细菌悬液取出，用ddh2o冲洗表面，内容物全部吹打并涂布于lb琼脂平板，37℃条件下厌氧培养24h，记录菌落形成单位(cfu)，减去空白趋化缓冲液的毛细管细菌数进行校正，得到趋化细菌数目，并计算趋化性指数。

13、所述步骤a4中，软琼脂平板趋化试验具体步骤为：

14、将培养至对数期的菌液(od600为0.5-0.7)，使用趋化缓冲液洗涤3次，在1200g下低速离心3min后，将10μl浓度为100μm的碳源底物效应物点板于含0.25％(w/v)琼脂的固体msb中，4℃过夜；在趋化平板中央效应物原点两侧等距离接种菌液1μl，共接种2个点，然后将趋化平板在30℃下培养20-30h后拍照。

15、a5、菌株16s rdna基因序列鉴定：用细菌基因组dna小量制备试剂盒提取牛月形单胞菌dna并以其为扩增模板，退火温度为50℃，35个循环，进行pcr扩增，电泳观察结果；用pcr产物回收试剂盒回收特异dna片段的pcr产物，将其连接在pmd18-t载体上，16℃连接过夜；将连接产物转化入大肠杆菌dn5α株感受态细胞中，摇菌1h后将菌液涂在amp+的lb琼脂平板上37℃恒温振荡培养12-16h；用日常型质粒dna小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果；pcr扩增重组质粒，电泳观察并送takapa公司对其测定序列，由dnasis软件分析测序结果；设计细菌16s rrna基因片段pcr扩增通用引物，上游引物序列为：5′agagtttgatc(a/c)tgg3′，下游引物序列为：5′ggactac(a/t/c)agggtatctaat 3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；提取分离菌株的基因组dna扩增其16srdna基因片段与genbank中发表的牛月形单胞菌16s rrna进行基因序列同源性分析。

16、本发明的有益效果：

17、本发明技术方案中，基于反刍动物瘤胃液采用厌氧分离技术从奶牛瘤胃中分离培养牛月形单胞菌，通过对其形态观察、培养条件、底物特性、生理生化特性、16s rrna基因序列分析、同源性分析等手段，确定分离菌株，为靶向分离瘤胃来源牛月形单胞菌提供技术手段。

技术特征：

1.一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a4中，毛细管趋化试验具体步骤为：

3.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a4中，软琼脂平板趋化试验具体步骤为：

4.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a5中，菌株16s rdna基因序列鉴定具体步骤为：用细菌基因组dna小量制备试剂盒提取牛月形单胞菌dna并以其为扩增模板，退火温度为50℃，35个循环，进行pcr扩增，电泳观察结果；用pcr产物回收试剂盒回收特异dna片段的pcr产物，将其连接在pmd18-t载体上，16℃连接过夜；将连接产物转化入大肠杆菌dn5α株感受态细胞中，摇菌1h后将菌液涂在amp+的lb琼脂平板上37℃恒温振荡培养12-16h；用日常型质粒dna小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果；pcr扩增重组质粒，电泳观察并送takapa公司对其测定序列，由dnasis软件分析测序结果；设计细菌16s rrna基因片段pcr扩增通用引物，上游引物序列为：5′agagtttgatc(a/c)tgg3′，下游引物序列为：5′ggactac(a/t/c)agggtatctaat 3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；提取分离菌株的基因组dna扩增其16s rdna基因片段与genbank中发表的牛月形单胞菌16s rrna进行基因序列同源性分析。

5.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a32中，过滤除菌的维生素k1溶液、5mg/ml血红素溶液、灭菌瘤胃液、马血清和二柳苏糖醇的用量比为0.5ml：2.5ml：25ml：25ml：0.1g。

6.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a32中，厌氧培养箱条件为：85％氮气、10％二氧化碳和5％氢气。

7.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a4中，多糖包括淀粉、葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖中的一种。

8.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述步骤a4中，二糖包括纤维二糖、木二糖、甘露二糖中的一种。

9.根据权利要求1所述的一种牛月形单胞菌分离培养方法，其特征在于：所述所述步骤a4中，单糖包括葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖中的一种。

技术总结本发明涉及一种牛月形单胞菌分离培养方法，属于微生物技术领域，包括以下步骤：A1、基于瘤胃插管技术进行瘤胃液采集；A2、培养前的材料制备与准备工作；A3、牛月形单胞菌的分离；A4、利用常规细菌接种法进行生化试验；A5、菌株16S rDNA基因序列鉴定。本发明技术方案中，基于反刍动物瘤胃液采用厌氧分离技术从奶牛瘤胃中分离培养牛月形单胞菌，通过对其形态观察、培养条件、底物特性、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析、同源性分析等手段，确定分离菌株，为靶向分离瘤胃来源牛月形单胞菌提供技术手段。技术研发人员：薛茗元,杨华,肖英平,王成,马剑钢,胡瑞彬受保护的技术使用者：湘湖实验室（农业浙江省实验室）技术研发日：技术公布日：2024/8/20