一种基于整合素拮抗剂或抑制剂维持和提高干细胞多能性的方法

本发明涉及一种基于整合素拮抗剂或抑制剂维持和提高干细胞自我更新能力和多能性的方法。

背景技术：

1、干细胞(stem cells,sc)是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，escs)和成体干细胞(somatic stem cell)，而诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ips cells)，是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。目前，体外培养干细胞的基本原则是在促进干细胞永久性分裂增殖的同时,维持其未分化的状态,前者是对数量上的要求,后者是对其功能的保证。

2、胚胎干细胞来自于受精卵分裂发育成囊胚时期的内细胞团(inner cell mass,icm)，在发育上具有多方面潜能，能分化成为成体动物除胚胎外滋养层细胞的所有细胞类型。对于胚胎干细胞的应用和研究，前提是能维持其高水平的多能性。目前，针对于胚胎干细胞多能性的体外维持，广泛应用的方法主要有以下两种。其一为有饲养层细胞的培养体系，该体系通过物理手段(如γ射线)或化学手段(如丝裂霉素c)将胚胎成纤维细胞的细胞周期阻断后，作为胚胎干细胞的生长基质被以合适的密度铺在培养器皿中，其可以通过细胞之间接触和旁分泌的方式，有效地抑制胚胎干细胞分化并维持快速地增殖速度(doi:10.1089/ten.teb.2014.0547)。其二为无饲养层的培养体系，广泛应用的是2i+lif培养体系(doi:10.1038/nature06968)，该体系通过在培养基中添加两种小分子抑制剂(meki和gsk3i)，从而阻断两个可导致胚胎干细胞分化的信号通路，同时维持正常的自我更新，来维持胚胎干细胞的增殖速度和多能性，该体系无需制备饲养层细胞，只需要额外添加适宜浓度的小分子抑制剂即可。有饲养层细胞的培养体系中，因为要培养和制备饲养层细胞，难免需要耗费较多的实验经费和时间，且后期实验过程中需要将饲养层细胞去除后才能得到完全的胚胎干细胞样品，实验步骤较繁琐。在无饲养层的培养体系中，有文献报道长期地处在2i+lif培养体系中胚胎干细胞整体dna去甲基化(doi:10.1038/nsmb.2510)，造成一定程度上的基因组不稳定性以及发育潜能的缺失(doi:10.1038/nature23274)。

3、成体干细胞对哺乳动物组织很重要，在那里它们作为支持正常组织周转的储备，并可以在急性损伤后产生再生反应。目前成体干细胞治疗是一种先进的医疗手段，利用患者自身或他人的成体干细胞来修复、再生或替换受损、病变的细胞、组织乃至器官，从而治疗一系列的疾病。通常而言，进行干细胞治疗需要一定量的细胞，而现在面临的一个重要问题是体外培养成体干细胞的增殖潜能和多能性的维持具有局限性。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的首要目的是提供一种基于整合素拮抗剂或抑制剂维持和提高干细胞自我更新能力和多能性的方法，为干细胞体外维持及培养提供方便、有效、且尽可能地保留干细胞特性的培养体系。

2、对于目前广泛应用的体外维持干细胞多能性体系中的实验复杂性和不安全性，本发明提供的方法能够简单应用并稳定维持干细胞特性的可能。

3、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、无需制备饲养层细胞，只需在正常的干细胞完全培养基中添加40-100μm浓度的具有抑制整合素信号通路的拮抗剂或抑制剂，利用整合素的拮抗剂或抑制剂，与整合素的n端相互作用，将整合素锁定在其非活化构象中(如atn-161与整合素α5β1的β1区域的n端相互作用，将整合素α5β1锁定在其非活化构象中)，有效地减少整合素信号通路的激活，从而抑制干细胞分化，维持干细胞的自我更新能力和多能性的状态，且不影响干细胞的贴壁和增殖速度。

5、所述具有抑制整合素信号通路的拮抗剂或抑制剂选自小肽段拮抗剂atn-161(ac-phscn-nh2)、cilengitide trifluoroacetate、grgdsp、cyclo(-rgdfk)、sb273005及glpg0187，优选为atn-161。atn-161(ac-phscn-nh2)是一种来源于纤连蛋白协同区域的5-mer加帽肽段，在体外与α5β1和αvβ3结合，可阻止乳腺癌生长和转移。atn-161的处理可引起显著的肿瘤体积的减小，呈剂量依赖性；能够完全阻止或引起骨骼和软组织转移数量和发病率的减少。atn-161的处理还可导致体内磷酸化mapk表达的减少、微血管密度和肿瘤生长过程中细胞增殖的减少。atn-161在血浆中半衰期相当短，而在肿瘤中半衰期相对较长，说明该肽段在肿瘤中通过与其靶点发生一个持久的相互作用而发挥效果。

6、进一步的，对于无饲养层细胞的胚胎干细胞培养体系

7、所述的培养基成分为：knock out dmem、n2/b27、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、双抗、lif、pd184352、chir99021和β-巯基乙醇；其中添加的atn-161的浓度为20-80μm。当atn-161浓度达到60μm时，其能够代替2i+lif体系中的mek抑制剂pd184352，控制多能性的核心转录因子oct4和sox2的蛋白和转录水平维持在与2i+lif完全培养基组的小鼠胚胎干细胞接近的水平，atn-161在2i+lif培养体系中用作mek抑制剂。

8、进一步的，对于有饲养层细胞的胚胎干细胞培养体系

9、在胚胎干细胞体外培养过程中，接种细胞之前10-15min使用0.1％明胶预处理培养板(皿)以获得更好的细胞贴壁效果，培养基成分为knock out dmem、knock out血清替代物、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、双抗、lif和β-巯基乙醇，除此之外，添加40-100μm浓度的atn-161，培养过程中每24h更换新鲜的培养基。在atn-161浓度达到60μm时，其能够代替有饲养层细胞培养体系中的饲养层细胞，控制多能性的核心转录因子oct4和sox2的蛋白和转录水平维持在与正常培养在饲养层细胞上的胚胎干细胞接近的水平。

10、进一步的，对于其它干细胞的培养体系

11、在其它干细胞的培养过程中，如成体干细胞、诱导多能干细胞等，在正常培养该细胞的培养基的基础上添加40-100μm浓度的atn-161，培养过程中每24h更换新鲜的培养基，其能够提高控制多能性的核心转录因子oct4、sox2和nanog的蛋白和转录水平。

12、本发明的另一个目的是提供一种基于整合素拮抗剂或抑制剂维持和提高干细胞自我更新能力和多能性的用途，所述干细胞，是指胚胎干细胞和诱导多能干细胞以及成体干细胞。

13、本发明的关键点在于通过拮抗剂或抑制剂阻断整合素信号后可以维持甚至提高干细胞自我更新能力和多能性。

14、本发明的有益效果：

15、(1)本发明所述的整合素拮抗剂或抑制剂，在浓度达到60μm时，能够一定程度上代替上述有饲养层细胞培养体系中的饲养层细胞，将大多数胚胎干细胞维持在较高的多能性水平，将控制多能性的核心转录因子的蛋白质与mrna表达量维持在较高的水平。同时，能够一定程度上代替2i+lif体系中的mek inhibitor pd184352，将大多数胚胎干细胞维持在较高的多能性水平，将控制多能性的核心转录因子的蛋白质与mrna表达量维持在较高的水平。

16、(2)本发明所述的整合素拮抗剂或抑制剂，在浓度达到80μm时，能够在原有细胞培养基础上进一步提高核心转录因子的蛋白质与mrna表达量，该细胞包含但不限于成体干细胞和诱导多能干细胞。

17、(3)本发明还提供了整合素拮抗剂或抑制剂维持和提高干细胞自我更新能力和多能性的新用途。